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Qu'est-ce qu'un coefficient de contrôle de flux ?


Dans l'analyse de contrôle métabolique, un certain nombre de coefficients sont définis, y compris les coefficients de contrôle de flux. Comment ce coefficient est-il défini et que mesure-t-il ?


Le coefficient de contrôle du flux mesure le changement relatif du flux de la voie à l'état d'équilibre en réponse à un changement relatif de l'activité enzymatique. Mathématiquement, il est défini par :

$C^J_{e_i} = frac{dJ}{de_i} frac{e_i}{J}$

Étant donné que l'activité enzymatique est proportionnelle à la concentration en enzyme, le coefficient de contrôle du flux est souvent défini par rapport à la concentration en enzyme, $e_i$.

Cela peut également être exprimé sous forme de journal :

$C^J_{e_i} = frac{dln J}{dln e_i}$

Il peut également être exprimé approximativement sous la forme d'un rapport de variations en pourcentage :

$C^J_{e_i} = frac{J\%}{e_i\%} $

Cette définition le rend facile à mesurer. Par exemple, si l'activité d'une enzyme donnée est modifiée d'un facteur de 1,5, ce qui entraîne une variation de 1,25 fois du flux en régime permanent, alors la valeur du coefficient de contrôle du flux est d'environ 1,25/1,5 = 0,83. Étant donné que les coefficients de contrôle de flux sont mesurés à l'aide de changements relatifs, les coefficients sont sans dimension.

Les coefficients de contrôle de flux sont utiles pour évaluer dans quelle mesure une réaction enzymatique donnée influence le flux dans une voie.

Pour plus d'informations, je vous recommande le document suivant :

Kacser, Henrik, James A. Burns, H. Kacser et D. A. Fell. "Le contrôle des flux." (1995) : 341-366.


Flux (biologie)

En général, flux en biologie se rapporte au mouvement d'une substance entre les compartiments. Il existe plusieurs cas où la notion de flux est importante.

  • Le mouvement des molécules à travers une membrane : dans ce cas, le flux est défini par la vitesse de diffusion ou de transport d'une substance à travers une membrane perméable. Sauf dans le cas du transport actif, le flux net est directement proportionnel à la différence de concentration à travers la membrane, à la surface de la membrane et à la constante de perméabilité de la membrane.
  • En écologie, le flux est souvent considéré au niveau de l'écosystème - par exemple, la détermination précise des flux de carbone à l'aide de techniques telles que la covariance turbulente (au niveau régional et mondial) est essentielle pour modéliser les causes et les conséquences du réchauffement climatique. fait référence au débit de métabolites à travers un réseau biochimique, le long d'une voie métabolique linéaire ou à travers une seule enzyme. Un calcul peut également être fait du flux de carbone ou du flux d'autres composants élémentaires des biomolécules (par exemple l'azote). L'unité générale du flux est la masse chimique/temps (par exemple, micromole/minute mg/kg/minute). Les taux de flux dépendent d'un certain nombre de facteurs, notamment : la concentration en enzymes la concentration en précurseurs, produits et métabolites intermédiaires, la modification post-traductionnelle des enzymes et la présence d'activateurs ou de répresseurs métaboliques. Le flux métabolique dans les systèmes biologiques peut faire référence aux taux de biosynthèse de polymères ou d'autres macromolécules, telles que les protéines, les lipides, les polynucléotides ou les glucides complexes, ainsi que le flux de métabolites intermédiaires à travers les voies. L'analyse du contrôle métabolique et l'analyse du bilan des flux fournissent des cadres pour comprendre les flux métaboliques et leurs contraintes.

Le flux est le mouvement net de particules à travers une zone spécifiée dans une période de temps spécifiée. [1] Les particules peuvent être des ions ou des molécules, ou elles peuvent être plus grosses, comme des insectes, des rats musqués ou des voitures. Les unités de temps peuvent aller de la milliseconde au millénaire. Le flux n'est pas la même chose que la vitesse ou la vitesse ni la même chose que la densité ou la concentration. Le mouvement en lui-même ne suffit pas.


Concernant la mesure des coefficients de contrôle de flux par titrage enzymatique. États stables, quasi-stationnaires et rôle du temps dans les expériences analytiques de contrôle

Une méthode établie pour déterminer les coefficients de contrôle du flux est la méthode de titrage enzymatique dans laquelle le changement du flux de la voie lors d'un changement de la concentration en enzyme est mesuré. Dans cette étude, l'application de cette méthode à une simple voie reconstituée a été étudiée par des mesures simulées. La voie était supposée être dans l'état quasi-stationnaire, qui est la réalisation expérimentale de la construction mathématique « état stationnaire ». Il a été montré que les coefficients de contrôle de flux, calculés d'une manière qui imite leur détermination expérimentale, dépendaient fortement du temps. Initialement, le coefficient de contrôle du flux calculé était élevé pour l'enzyme adjacente à la réaction surveillant le flux, et la valeur à l'état d'équilibre était surestimée. De même, les coefficients de contrôle de flux ont été sous-estimés pour les enzymes plus éloignées de la réaction de surveillance. Il a été démontré que l'évolution temporelle observée des coefficients de contrôle de flux simulés reflète le fait que les systèmes expérimentaux ne sont pas en régime permanent mais quasi-stationnaire. Pour une voie à l'état quasi-stationnaire, certains des problèmes liés aux expériences de titrage enzymatique peuvent être surmontés en permettant au système de se détendre pendant un intervalle de temps important par rapport au temps de renouvellement des intermédiaires de voie regroupés.


Les références

Seules les sources spécifiquement mentionnées sont répertoriées ici. Pour trouver où une référence est citée, suivez le lien indiqué par [@] qui la suit. Une liste plus longue est fournie avec la version Web du chapitre 12 de la 3e édition (2004) de Fundamentals of Enzyme Kinetics, et d'autres références peuvent être trouvées dans les articles répertoriés.

Cette liste de références a un urgent besoin d'être mise à jour ! Les suggestions d'inclusion seront les bienvenues.

    G. C. Brown, R. Hafner et M. D. Brand (1990) Une approche descendante pour la détermination des coefficients de contrôle dans la théorie du contrôle métabolique. EUR. J. Biochem. 188, 321-325 [@] A. Cornish-Bowden (1995) Analyse du contrôle métabolique en théorie et en pratique. Av. Mol. Cellule. Biol. 11, 21-64 [@] A. Cornish-Bowden (2004) Fundamentals of Enzyme Kinetics (3e éd.), pp. 239-270, Portland Press, Londres [@] A. Cornish-Bowden et M. L. Cárdenas, eds. (1990) Contrôle des processus métaboliques, Plenum Press, New York [@]
  • A. Cornish-Bowden et M. L. Caacuterdenas, éd. (2000) Implications technologiques et médicales de l'analyse du contrôle métabolique, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht [@] B. Crabtree et E. A. Newsholme (1987) La dérivation et l'interprétation des coefficients de contrôle. Biochimie. J. 247, 113-120 [@] D. A. Fell (1992) Analyse du contrôle métabolique : une étude de son développement théorique et expérimental. Biochimie. J. 286, 313-330 [@] D. A. Fell (1997) Understanding the Control of Metabolism, Portand Press, Londres [@] R. Heinrich et T. A. Rapoport (1974) Un traitement linéaire à l'état d'équilibre des chaînes enzymatiques. Critique du théorème du croisement et d'une procédure générale pour identifier les sites d'interaction avec un effecteur. EUR. J. Biochem. 42, 89-95 [@] R. Heinrich et S. Schuster (1996) The Regulation of Cellular Systems, Chapman et Hall, New York [@] H. Kacser et J. A. Burns (1973) The control of flux. Symp. Soc. Exp. Biol. 27, 65-104 [@] H. Kacser, J. A. Burns et D. A. Fell (1995) Le contrôle du flux. Biochimie. Soc. Trans. 23, 341-391 [@] M. A. Savageau (1976) Analyse des systèmes biochimiques : une étude de la fonction et de la conception en biologie moléculaire, Addison-Wesley, Reading, Massachusetts. [@]

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Dernière mise à jour : 6 février 2012
Dernière mise à jour significative : 4 janvier 2011
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12.6.1 Propriétés de connectivité

Pour une voie non ramifiée de m enzymes, il existe une relation de sommation pour les coefficients de contrôle de flux, et (m - 1) relations de sommation entre les coefficients de contrôle de concentration, mais il existe m coefficients de contrôle de flux et m(m - 1) coefficients de contrôle de concentration, ou m 2 coefficients de contrôle en tout. En effet, par conséquent, les relations de sommation fournissent m équations relatives m 2 inconnues. Pour calculer toutes les inconnues, une autre m(m - 1) des équations sont nécessaires. Ceux-ci proviennent du propriétés de connectivité, qui va maintenant être décrit.

Si une concentration enzymatique eje et une concentration de métabolite sj changer simultanément de deje et dsj respectivement de manière à ne produire aucun effet sur le taux vje par l'enzyme en question, les changements doivent être liés comme suit :

Une équation correspondante peut être écrite pour chaque valeur de je, nous pouvons donc facilement calculer les petits changements qui doivent être apportés à toutes les concentrations d'enzymes pour produire un changement particulier dans une concentration de métabolite, en laissant toutes les autres concentrations de métabolites et tous les taux (et donc tous les flux) inchangés. S'il n'y a pas de changement de flux pour une série particulière de perturbations enzymatiques, l'équation 12.18 peut s'écrire comme suit :

et en substituant l'équation 12.23 pour chaque valeur de je en cela et en annulant le facteur commun -dsj/sj de tous les termes il devient

H. Kacser et J. A. Burns (1973) Symposiums sur le contrôle du flux de la Society for Experimental Biology 27, 65�, révisé par H. Kacser, J. A. Burns et D. A. Fell (1995) Biochemical Society Transactions 23, 341�

Ceci exprime maintenant la propriété de connectivité entre les coefficients de contrôle de flux et les élasticités, qui a été découverte par Kacser et Burns (1973). Dans une voie réelle, certaines des élasticités seront normalement nulles, car il est peu probable que chaque métabolite ait un effet significatif sur chaque enzyme. Par conséquent, certains des termes des sommes comme celui de l'équation 12.25 seront généralement manquants, mais dans cette section, j'inclurai tous les termes qui pourraient en principe apparaître.

Comme aucune concentration de métabolite sauf sj a été modifiée, une équation similaire à l'équation 12.24 s'applique à tout métabolite Sk Pour qui k &ne j :

mais si k = j il y a un changement dsj/sj et donc

H.V. Westerhoff et Y.-D. Chen (1984) Comment les activités enzymatiques contrôlent-elles les concentrations de métabolites ? Un théorème supplémentaire dans la théorie du contrôle métabolique European Journal of Biochemistry 142, 425�

et la substitution de l'équation 12.23 comme précédemment conduit aux propriétés de connectivité entre les coefficients de contrôle de la concentration et les élasticités (Westerhoff et Chen, 1985) :

Pour une voie non ramifiée de m il y a des enzymes (m - 1) des équations similaires à l'équation 12.25, une pour chaque métabolite, et (m - 1)2 équations similaires à l'équation 12.28, une pour chaque combinaison de deux métabolites, et ensemble elles fournissent le m(m - 1) des équations supplémentaires qui doivent être combinées avec les m relations de sommation pour fournir m 2 équations nécessaires pour calculer tous les coefficients de contrôle à partir des élasticités.

12.6.2 Coefficients de contrôle dans un parcours en trois étapes

D. A. Fell et H. M. Sauro (1985) Le contrôle métabolique et son analyse. Relations supplémentaires entre les élasticités et les coefficients de contrôle European Journal of Biochemistry 148, 555�

D. A. Fell (1992) Analyse du contrôle métabolique: une étude de son développement théorique et expérimental Biochemical Journal 286, 313�

Bien que des complications surviennent avec les voies ramifiées, celles-ci ne modifient pas le point essentiel qu'il existe un nombre suffisant de relations indépendantes entre coefficients de contrôle et élasticités pour qu'il soit en principe possible de calculer l'ensemble des coefficients de contrôle. Cela établit non seulement que les propriétés en régime permanent (coefficients de contrôle) d'un système complet découlent des propriétés de ses composants (élasticités), mais cela montre également comment le calcul peut être effectué. La vraie solution de m 2 équations simultanées est compliqué si m n'est pas trivialement petit, et dans la pratique actuelle, le problème est traité comme un problème d'algèbre matricielle (Fell et Sauro, 1985 Fell, 1992). Je n'entrerai pas dans les détails ici, mais examinerai plutôt les résultats d'un tel calcul pour un exemple simple.

Pour la trajectoire en trois étapes illustrée dans l'équation 12.29, les trois coefficients de contrôle de flux peuvent être exprimés en termes d'élasticités comme suit :

Les numérateurs sont placés sur les termes correspondants dans les dénominateurs pour souligner que non seulement le dénominateur est identique dans les trois expressions, mais aussi qu'il consiste en la somme des trois numérateurs, conformément à la relation de sommation, équation 12.15. Chaque terme du dénominateur consiste en un produit d'élasticités, une élasticité pour chaque métabolite interne du système, chaque numérateur est constitué des termes du dénominateur qui ne contiennent pas l'activité de l'enzyme dont le coefficient de contrôle est exprimé, par exemple, l'équation 12.32 fait référence à E3, donc le numérateur ne contient aucune élasticité avec l'exposant v3.

Les signes moins dans les équations 12.30-32 proviennent naturellement de l'algèbre. Nous ne devrions pas leur permettre de nous induire en erreur en nous faisant croire que l'un des termes individuels des équations est négatif. Dans des conditions normales (définies comme dans la section 12.3.2 comme des conditions où il n'y a pas d'inhibition de substrat ou d'activation de produit), la combinaison d'élasticités de substrat positives avec des élasticités de produit négatives rend tous les termes des trois équations positifs.

Il existe des relations correspondantes pour chaque concentration de métabolite, par exemple, pour s1:

Ces expressions ont le même dénominateur que celles des coefficients de contrôle de flux, équations 12.30-32, mais maintenant chaque terme du numérateur contient une élasticité de moins que les termes du dénominateur, car la concentration s1 qui apparaît en exposant sur le côté gauche de l'équation ne se produit pas dans les élasticités du numérateur. Comme auparavant, l'enzyme modulée est absente de tous les produits, et une enzyme supplémentaire est également absente de chaque produit. Chaque terme du numérateur apparaît deux fois dans les trois expressions, avec des signes opposés par exemple, le terme de l'équation 12.33 correspond au terme - de l'équation 12.34. Cette correspondance des termes du numérateur garantit que la relation de sommation, l'équation 12.16, est respectée.

12.6.3 Expression des relations de sommation et de connectivité sous forme matricielle

Bien que j'évite autant que possible l'algèbre matricielle dans ce livre, les lecteurs qui la connaissent peuvent trouver utile d'exprimer les résultats de la section précédente afin de faciliter la comparaison avec les articles de synthèse qui utilisent la formulation matricielle. Cela devient de toute façon presque indispensable pour pousser l'analyse du contrôle métabolique au-delà du niveau le plus élémentaire.

Considérons, à titre d'exemple, l'équation suivante, dans laquelle je désignerai la première matrice comme la C matrice, la seconde en tant que &epsilon matrice, et le membre de droite comme matrice unitaire :

Notez tout d'abord que la rangée supérieure du C matrice contient les trois coefficients de contrôle de flux, le deuxième et le troisième les coefficients de contrôle de concentration pour les deux intermédiaires S1 et S2 respectivement. Les &epsilon matrice contient un vecteur unitaire comme première colonne, et les autres entrées contiennent toutes les élasticités, dont deux, et , sont remplacés par zéro car S1 est supposé dans l'équation 12.29 n'avoir aucun effet sur E3 et S2 est supposé n'avoir aucun effet sur E1. Le produit de la première rangée de C et la première colonne de &epsilon donne l'entrée en haut à gauche de la matrice unitaire, qui est 1, et exprime ainsi la relation de sommation pour les coefficients de contrôle de flux (comparer l'équation 12.15 ou 12.20). De la même manière, les relations de sommation pour les coefficients de contrôle de la concentration sont exprimées par les produits des autres rangées de C avec la première colonne de &epsilon. La relation de connectivité pour les coefficients de contrôle de flux est exprimée par le produit de la rangée supérieure de C avec n'importe quelle colonne de &epsilon à part le premier. Les relations de connectivité pour les coefficients de contrôle de concentration sont exprimées par tous les autres produits possibles qui n'ont pas été explicitement mentionnés.

12.6.4 Relation de connectivité pour un métabolite non impliqué dans la rétroaction

Chaque métabolite a au moins deux élasticités non nulles, car chaque métabolite affecte les taux de l'enzyme dont il est le substrat et de l'enzyme dont il est le produit. Cependant, les métabolites qui ne sont pas impliqués dans les effets de rétroaction ou d'anticipation et ne sont pas des substrats ou des produits de plus d'une enzyme n'auront que ces deux élasticités non nulles, et la relation de connectivité prend alors une forme plutôt simple. Par exemple, pour S1 dans l'équation 12.29, on a

ce qui montre que le rapport des coefficients de contrôle de flux de deux enzymes consécutives est égal à moins l'inverse du rapport des élasticités du métabolite de connexion (d'où le nom relation de connectivité ):

Cette relation permet de cheminer le long d'un chemin reliant les coefficients de contrôle par paires, et comme les coefficients de contrôle sont en principe beaucoup plus difficiles à mesurer directement que les élasticités, c'est un avantage important.

12.6.5 Le coefficient de contrôle du flux d'une enzyme pour le flux par sa propre réaction

L'expression de plus en plus algébrique de l'analyse du contrôle métabolique, et surtout l'utilisation croissante de l'algèbre matricielle, peut entraîner des propriétés obscures qui sont assez évidentes si l'on prend soin de ne pas perdre de vue la chimie sous-jacente. Un exemple est fourni par le degré de contrôle exercé par une enzyme Eje sur le flux à travers la réaction qu'il catalyse. Si nous ignorons la complication de plusieurs enzymes dans le système qui catalysent la même réaction (c'est-à-dire que nous ignorons la possibilité d'isoenzymes), alors il est évident que le taux vje ne dépend que de l'activité de l'enzyme elle-même telle que déterminée par sa concentration et celles de son propre substrat Sje - 1 et produit Sje tel qu'il est détecté à travers leurs élasticités non nulles, et celles de tout autre métabolite avec des élasticités non nulles, que nous pouvons représenter par un intermédiaire arbitraire Sk. Ainsi, le même genre d'expérience de pensée qui nous a conduit à l'équation 12.17 donnera l'expression suivante :

On peut écrire le flux en régime permanent Jjeà travers l'étape catalysée par Eje à gauche de cette expression plutôt que vje car en régime permanent ils sont identiques. Diviser tous les termes par vjeeje/eje (ou Jjeeje/eje) et en multipliant le cas échéant par des fractions équivalant à l'unité (telles que sje-1/sje-1)

Le membre de gauche de cette équation est la définition du coefficient de contrôle de flux , le premier terme du membre de droite est l'élasticité de Eje par rapport à son propre taux, généralement supposé égal à l'unité, et chacun des autres termes peut être reconnu comme une élasticité multipliée par un coefficient de contrôle. En faisant toutes les substitutions appropriées, l'équation peut donc s'écrire comme suit :

R. Heinrich et T.A.Rapoport (1974) Une théorie linéaire à l'état stationnaire des chaînes enzymatiques : propriétés générales, contrôle et force effectrice European Journal of Biochemistry 42, 89󈟋

Cette équation exprime maintenant l'idée importante que le coefficient de contrôle de flux de toute enzyme pour le flux à travers sa propre réaction est complètement déterminé par la somme des produits de ses élasticités non nulles avec les coefficients de contrôle de concentration correspondants (Heinrich et Rapoport, 1974) .

Bien que seuls trois métabolites apparaissent du côté droit de l'équation 12.40, représentant les trois classes de métabolites qui ont généralement des élasticités non nulles, pour toute enzyme donnée, le nombre peut être supérieur ou inférieur à trois. Elle ne sera cependant normalement pas inférieure à deux, car les substrats et les produits ont toujours des élasticités non nulles : algébriquement cela doit être vrai, et même numériquement il sera inhabituel qu'une élasticité de substrat ou de produit soit négligeable.

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Dernière mise à jour significative : 10 avril 2006
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Coefficients de contrôle de flux déterminés par titrage d'inhibiteur : conception et analyse d'expériences pour minimiser les erreurs.

Cet article est une étude sur les effets de l'erreur expérimentale sur les valeurs estimées des coefficients de contrôle de flux obtenus en utilisant des inhibiteurs spécifiques. Deux techniques possibles d'analyse des données expérimentales sont comparées : une méthode d'extrapolation simple (dite méthode des graphes) et une méthode d'ajustement de fonction non linéaire. Pour ces techniques, les sources d'erreurs systématiques sont identifiées et les effets des erreurs systématiques et aléatoires sont quantifiés, en utilisant à la fois une analyse statistique et un calcul numérique. Il est montré que la méthode du graphique est très sensible aux erreurs aléatoires et, dans toutes les conditions étudiées, que la méthode d'ajustement, même dans des conditions où les hypothèses sous-jacentes à la fonction ajustée ne sont pas vérifiées, a surpassé la méthode du graphique. Les moyens possibles de concevoir des expériences pour minimiser les effets des erreurs expérimentales sont analysés et discutés.


Avis jusqu'à présent.

Le taux de FLUX de particules (dn/dt, c'est-à-dire le nombre de particules se déplaçant dans un temps spécifié) à travers une zone est le FLUX. Le symbole du flux est J et les unités de flux sont mol m -2 s -1 .

Le nombre de particules n dans un certain volume V est la concentration C (C = n/V) de sorte que nous pouvons également exprimer l'équation de flux en termes de changement de concentration avec le temps. Les unités de dC/dt sont mol cm -3 s -1 .

La première loi de Fick&rsquos stipule que le flux est proportionnel au GRADIENT DE CONCENTRATION et que la constante de proportionnalité D est le COEFFICIENT DE DIFFUSION.

Qu'est-ce que le coefficient de diffusion, , représentent vraiment biologiquement? Une façon de comprendre cela est de regarder les unités de pour voir ce qu'il décrit vraiment. Les unités de sont la longueur 2 /temps (m 2 s -1 ), et généralement rapportés en cm 2 /sec (cm 2 s -1 ). Le coefficient de diffusion () décrit le temps qu'il faut à une substance particulière (comme l'oxygène ou les protéines, etc.) pour se déplacer dans un milieu particulier (comme l'eau ou la mélasse).


Orientations et défis futurs

Comme illustré ci-dessus, l'analyse du contrôle métabolique est particulièrement utile pour décrire les aspects théoriques de la régulation. Cette utilité continuera à se développer dans l'ère post-génomique, en particulier avec les progrès de la in vivo imagerie et quantification des protéines et des métabolites (par exemple, à l'aide d'un traceur par résonance magnétique nucléaire). Les futurs efforts de modélisation nécessiteront l'intégration ou l'échantillonnage des approches mathématiques actuelles, y compris l'analyse du contrôle métabolique, ainsi que le développement de nouvelles approches théoriques et de nouveaux outils. À mesure que les modèles deviennent plus complexes et intégrés pour refléter le volume même des réactions se produisant simultanément dans une cellule, l'incorporation des méthodes de Monte Carlo (échantillonnage aléatoire) et de l'analyse par éléments finis (approximations basées sur la subdivision en éléments plus petits et plus gérables) est susceptible d'être nécessaire. De plus, les plateformes et bases de données nécessaires à la construction de modèles de complexité croissante doivent être développées de manière organisée et collaborative et être largement accessibles [34]. L'accès aux ressources de calcul requises deviendra également un problème. Peut-être qu'un institut similaire au National Center for Atmospheric Research [35], qui facilite la recherche internationale sur le changement climatique mondial, pourrait aider à coordonner et à soutenir les efforts de modélisation biologique.


Revoir

Introduction

La biologie des systèmes est un domaine scientifique relativement nouveau qui utilise, de manière itérative, une combinaison de données quantitatives, de modélisation mathématique et de théorie pour parvenir à une compréhension « au niveau des systèmes ». Nous interprétons cela comme une compréhension de la façon dont le comportement du système, qu'il s'agisse de la fréquence d'un micro-organisme dans une communauté microbienne ou du flux à travers une voie métabolique, dépend des propriétés des composants du système et des interactions entre les composants. . Ce n'est donc pas le contraire du réductionnisme : dans sa manifestation ascendante, la biologie des systèmes utilise les données du réductionniste (propriétés des composants), et construit une image du comportement collectif prédit si les interactions sont incluses. Dans sa manifestation descendante, la biologie des systèmes vise l'identification de composants et d'interactions à partir de grands ensembles de données (omiques), où elle a des liens étroits avec (et peut même être impossible à distinguer) de la bioinformatique.

La biologie des systèmes a considérablement pénétré la biologie dominante [1]. Toujours dans le domaine de la recherche sur les bactéries lactiques, les approches de biologie des systèmes ont toute une tradition. Dans cette revue, nous souhaitons illustrer ce que la biologie des systèmes a apporté au domaine des LAB, à travers un certain nombre de cas sélectionnés. Cette revue met davantage l'accent, mais pas exclusivement, sur l'approche ascendante et sur la physiologie microbienne, en particulier le métabolisme. Nous commencerons par les modèles métaboliques à l'échelle du génome et leurs approches, qui peuvent être considérés comme un compromis entre la biologie des systèmes ascendante et descendante. Ensuite, après avoir identifié les limites spécifiques de ce type de modèles, nous nous concentrerons sur les modèles cinétiques de la physiologie des LAB, pour discuter de la "cause effective" (le comment) et de la "cause finale" (le pourquoi) de la régulation du métabolisme dans les LAB. Enfin, nous allons développer et considérer les cellules comme des composants d'une communauté de cellules et discuter des stratégies de régulation métabolique dans le cadre de la dynamique des populations. Nous terminerons par une perspective de ce que nous pensons être certains des développements futurs dominants dans le domaine de la biologie des systèmes, pertinents pour la recherche en LAB.

Modèles métaboliques à l'échelle du génome

L'intérêt actuel pour la biologie des systèmes est largement alimenté par des techniques à haut débit qui génèrent de grandes quantités de données. Il existe un consensus général sur le fait que la génomique fonctionnelle a un potentiel énorme dans les sciences de la vie, en particulier en biotechnologie et en médecine. Comment utiliser ces technologies le plus efficacement possible, que ce soit pour une compréhension fondamentale, la découverte de biomarqueurs ou des applications biotechnologiques concrètes, est un domaine de recherche active. Il est clair que le volume et la complexité des données deviennent trop importants pour être pris en charge par les seuls biologistes, surtout lorsque ces derniers sont mal formés aux mathématiques avancées et au calcul (ce qui est malheureusement encore largement le cas). Du point de vue du biologiste, il existe donc un besoin compréhensible d'aide pour extraire, interpréter et utiliser les ensembles de données qu'ils collectent. De telles activités nécessitent une modélisation d'une forme ou d'une autre [2].

La biostatistique et la bioinformatique offrent une aide dans l'analyse d'ensembles de données à l'échelle du génome, mais elles reposent souvent sur une analyse purement mathématique et statistique [3]. Bien qu'extrêmement utile, il ignore ce que l'on appelle souvent les « données héritées », c'est-à-dire le vaste corpus de connaissances biologiques qui est souvent dispersé dans la littérature et donc peu accessible. De plus, de nombreuses techniques n'ont pas été conçues pour incorporer a priori connaissances, même si elles sont disponibles [3]. Les biologistes des systèmes « bottom-up », d'autre part, construisent des modèles mécanistes détaillés qui visent à une compréhension fondamentale du comportement des systèmes [1] (voir aussi la section sur le contrôle du métabolisme primaire des LAB).

L'utilisation de reconstructions à l'échelle du génome et de leurs modèles correspondants peut être considérée comme une approche intermédiaire, car elles combinent des données -omiques avec des stratégies de modélisation plus traditionnelles. Tous les aspects des modèles métaboliques à l'échelle du génome ont été largement examinés ces dernières années [4-10]. Dans cette section, nous décrirons certaines de ses applications aux réseaux métaboliques des LAB. Ces applications peuvent être divisées en trois domaines d'application principaux : (i) la bioinformatique avancée et l'analyse de données (ii) l'analyse quantitative et la prédiction de la fermentation et (iii) l'exploration et la découverte du potentiel métabolique.

Bioinformatique avancée et analyse de données

Un modèle métabolique à l'échelle du génome, ou reconstruction métabolique, n'est ni plus ni moins qu'un inventaire organisé manuellement de toutes les associations de réactions gène-protéine-métabolique d'un organisme [5, 11]. Il est basé sur une combinaison d'inférence bioinformatique de la fonction des gènes, de preuves expérimentales sous forme d'études biochimiques et de physiologie (par exemple, auxotrophies pour les acides aminés ou les vitamines [12]), et des recherches bibliographiques. Pour plus d'informations sur la façon de créer de tels modèles, nous nous référons à certaines revues sur ce sujet [4, 5, 11]. De nombreux modèles métaboliques à l'échelle du génome pour les bactéries lactiques sont disponibles [13-15]. Une fois les relations souvent complexes et plusieurs-à-plusieurs gène-protéine-réaction sont cartographiées, ces mêmes relations peuvent être utilisées pour l'intégration d'ensembles de données qui se réfèrent à ces constituants du réseau. En général, une reconstruction métabolique à l'échelle du génome fournit ce que Palsson a appelé un « contexte pour le contenu » [16], et une telle analyse des voies a été utilisée dans de nombreuses études, allant de l'interprétation métabolique des écrans de fitness ou des KO [17–19] , des études d'associations fonctionnelles [20], et des études sur l'évolution des génomes [21] et des réseaux métaboliques [22, 23]. Un exemple relativement simple dans la recherche LAB était l'utilisation de cartes métaboliques pour tracer des données de microarray. Cette analyse a été utilisée par Stevens et al [24] pour identifier le CO2 comme cause potentielle de retard de croissance dans les cultures aérées de L. plantarum. Une méthode plus formelle et statistique, précisément dans ce but, a été développée par le groupe de J. Nielsen, appelée métabolite reporter analyse [25].

Analyse quantitative et prédiction de fermentation

Les modèles métaboliques à l'échelle du génome sont des modèles stoechiométriques et peuvent donc être utilisés pour analyser (et parfois prédire) les flux dans les réseaux métaboliques, un domaine souvent appelé analyse des flux métaboliques (AMF, voir pour une excellente revue des différentes techniques de modélisation en ingénierie métabolique [26]). Dans ce domaine, l'accent a été principalement mis sur l'estimation des flux internes à partir des flux externes (taux de consommation et de production) et l'incorporation du marqueur 13 C dans les pools métaboliques [27]. Des modèles ont été développés spécifiquement pour des estimations de flux précises [28, 29], mais les modèles métaboliques à l'échelle du génome s'avèrent avoir beaucoup plus de degrés de liberté que les modèles stoechiométriques traditionnels utilisés pour l'analyse de flux (pensez de l'ordre de cent degrés de liberté, voir par exemple [15]). Ceci est principalement causé par le regroupement et les simplifications dans ce dernier cas : lorsque le modèle est construit sur la base du génome, de nombreuses voies cataboliques supplémentaires et voies d'absorption du sucre sont incluses, ce qui ne serait pas pertinent pour les modèles MFA dédiés.

Lorsque les données d'absorption et de production sont disponibles, une approche extrêmement utile consiste à définir ces données en tant que contraintes de flux dans le modèle, puis à effectuer une analyse d'équilibre de flux (FBA). La FBA nécessite un objectif (taux de production de biomasse, ou taux de production d'ATP) optimisé [9]. L'algorithme d'optimisation, appelé programmation linéaire, recherchera des distributions de flux qui maximiseront la fonction objectif. Surtout, l'espace de solution, c'est à dire. l'espace de toutes les distributions de flux réalisables (pas nécessairement optimales) est limité dans ce cas par les taux d'absorption et de production mesurés. Par conséquent, l'algorithme trouvera des optima à ces limites. Une mesure intéressante produite par l'algorithme de programmation linéaire est ce que l'on appelle le coût réduit : il quantifie de combien l'objectif augmenterait (ou diminuerait en cas de problème de minimisation) si la frontière était légèrement étirée [30]. Si ce coût réduit est non nul pour un flux d'absorption mesuré, cela indique que l'absorption de ce composé limite potentiellement la fonction objectif [15].

Il y a cependant un détail technique qui est important : bien que FBA soit assuré de trouver la valeur optimale globale pour la fonction objectif, il pourrait potentiellement y avoir de nombreuses distributions de flux différentes qui fournissent cette valeur. Ainsi, les solutions FBA ne sont pas uniques [31]. Il faut donc tester quelles réactions ont une valeur unique dans l'optimum, et lesquelles sont encore libres de varier. Ceci peut être testé avec une analyse de variabilité de flux (FVA), qui minimise et maximise chaque flux dans le réseau dans l'optimum [32]. La FVA sur des modèles de LAB contraints par des données expérimentales aboutit en fait à des solutions FBA assez uniques, et la plupart de la variabilité n'est que mineure et n'affecte pas l'analyse des coûts réduits. Ce n'est le cas que si le réseau est limité en énergie et que la production et la consommation d'ATP par formation de biomasse sont strictement couplées, libérant cette contrainte, il en résulte beaucoup plus de flexibilité, par ex. en cycles futiles [15]. Nos collègues ont trouvé la même chose pour E. coli modèles (Bruggeman, Kelk, Olivier et Stougie, résultats non publiés), ce n'est donc pas spécifique à LAB.

Dans deux études en L. plantarum, de nouvelles découvertes biologiques intéressantes ont été faites en appliquant une analyse à coût réduit. Dans une étude réalisée par nous, il a été constaté que le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée et aromatiques contribuait à la production d'ATP [15]. Une analyse détaillée a montré que le catabolisme de ces acides aminés constitue une activité transhydrogénase qui pourrait remplacer la production conventionnelle de NADPH par la partie oxydative de la voie des pentoses phosphates. Dans des conditions anaérobies, cela est bénéfique car il élimine l'excès de NADH et le convertit en NADPH nécessaire à la biosynthèse des acides gras. Cette activité transhydrogénase, cachée dans le réseau métabolique, a également été retrouvée dans Streptocoque thermophilus, qui manque des étapes oxydatives du PPP, et dans le catabolisme des acides aminés de cet organisme, pourrait être une source majeure de NADPH [14], bien qu'il existe également une enzyme GAPDH dépendante du NADP qui pourrait remplir ce rôle. Dans S. pyogenes (et de nombreux autres streptocoques), une situation similaire semble présente (Levering, résultats non publiés).

Dans le second cas, l'analyse des coûts réduits a été utilisée pour comprendre la production énigmatique d'acides aminés à « croissance zéro » dans L. plantarum[33]. Dans cette étude, la culture du rétentostat a été utilisée pour cultiver L. plantarum à des taux de croissance progressivement plus faibles, et de plus en plus d'acides aminés ont été sécrétés (tels que l'aspartate et l'arginine). Il est intéressant de noter que d'autres acides aminés, notamment les acides aminés aromatiques et à chaîne ramifiée, ont été absorbés en excès. Les données de puces à ADN ont montré une régulation à la hausse des groupes de gènes spécifiques aux plantes [34]. Étant donné que les produits cataboliques des acides aminés à chaîne ramifiée et aromatiques sont identiques ou similaires aux hormones végétales connues, ces données suggèrent que L. plantarum se comporte comme dans un environnement végétal [33]. Des coûts réduits ont montré que dans ces conditions, les acides aminés étaient sécrétés comme moyen alternatif d'exporter l'excès d'azote résultant du catabolisme des acides aminés ramifiés et aromatiques.

Exploration et découverte du potentiel métabolique

Ainsi, des modèles à l'échelle du génome peuvent être utilisés pour analyser des données complexes d'absorption et de production afin d'avoir un aperçu des limitations des fermentations et de la croissance, avec des applications dans l'optimisation des milieux de croissance. De plus, comme ils constituent un inventaire complet du potentiel métabolique d'un organisme, les modèles métaboliques à l'échelle du génome, contrairement aux modèles MFA traditionnels, peuvent conduire à de nouvelles découvertes de voies, comme illustré ci-dessus avec l'exemple de la transhydrogénase. Un autre exemple de ceci est un cycle de transcétolase putatif dans L. plantarum, ce qui pourrait entraîner une « combustion » aérobie du glucose en CO2 et H2O, avec un résultat étonnant de 6 moles d'ATP par mole de glucose [35]. Bien que ce cycle ne semble pas être opérationnel, il s'agit d'une voie « cachée » intéressante qui mérite peut-être d'être explorée plus avant.

Une autre option consiste à utiliser des modèles à l'échelle du génome pour des scénarios de simulation, ce qui serait très utile pour l'ingénierie métabolique et la biologie synthétique. De nouvelles voies peuvent être introduites in silico, et testé si tous les cofacteurs peuvent être fabriqués dans les bonnes proportions, le rendement théorique maximal peut être calculé, quels sous-produits seront formés, et ainsi de suite [36]. Inversement, les suppressions de gènes et/ou leurs combinaisons peuvent être analysées pour trouver des scénarios qui augmenteraient le flux vers le produit d'intérêt [37-39]. Bien qu'il ait été démontré que cette approche fonctionne dans E. coli, notamment par le groupe de S. Y. Lee [40, 41], peu d'exemples sont trouvés pour LAB. Cela est probablement dû à la pénétration encore relativement faible de la biologie des systèmes dans ce domaine traditionnel, et à son association avec l'alimentation, qui entrave évidemment les approches d'ingénierie métabolique et de biologie synthétique. Nous avons trouvé un exemple où FBA a été utilisé pour modéliser la surexpression de protéines dans L. lactis[42].

Limites des modèles à l'échelle du génome

Enfin, nous souhaitons rappeler au lecteur que les modèles métaboliques à l'échelle du génome sont des modèles stoechiométriques dépourvus de tout détail cinétique. Par conséquent, seuls les ratios de flux peuvent être calculés, c'est-à-dire que des questions telles que « combien sort si j'en mets autant ? » Peut être adressé. Ce sont des rendements, et les modèles stoechiométriques ne peuvent que prédire les rendements, ou dans le cas des rendements optimaux FBA. Dans la section sur l'optimalité, nous reviendrons sur ce point et soutiendrons que les organismes, et les bactéries lactiques en particulier, ne sont très souvent pas sélectionnés pour leur rendement ou leur efficacité, mais pour leur taux. Par conséquent, toutes les prédictions avec des modèles métaboliques à l'échelle du génome devront être pondérées par rapport à ce facteur de confusion potentiel (voir [43] pour des exemples). Les scénarios doivent être considérés comme des hypothèses pour guider les prochaines expériences, et en ce sens les modèles sont très utiles, malgré leurs limites.

Comment le métabolisme primaire des LAB est-il contrôlé (régulé ?)

Les explications mécanistes du comportement métabolique et de la façon dont celui-ci est manipulé par l'organisme lui-même, ou peut être manipulé par l'ingénierie métabolique, sont au cœur d'une grande partie de la recherche sur les LAB. Un certain nombre d'approches de modélisation mathématique ont été utilisées dans la recherche LAB pour intégrer les données expérimentales d'études biochimiques détaillées sur le processus de transport [44] et la cinétique enzymatique (voir, par ex.[45, 46]), complétées par des mesures de flux et de métabolites, telles que la RMN in-vivo [47, 48]. L'approche génomique de la physiologie des LAB s'est accompagnée ces dernières années de l'utilisation de modèles de réseaux métaboliques à l'échelle du génome [15], comme discuté ci-dessus. Ici, nous voulons discuter de plusieurs tentatives pour modéliser le métabolisme des LAB de manière dynamique, à l'aide de modèles cinétiques (basés sur des équations différentielles), dont plusieurs ont été publiés. L'accent sera mis sur les hypothèses et les limites de ces modèles, et dans quelle mesure ils ont permis de comprendre la richesse des données physiologiques, ou de générer des hypothèses.

Sans surprise, les efforts de modélisation cinétique dans L. lactis ont été presque exclusivement axés sur la glycolyse (voir la figure 1 pour les principales caractéristiques de la voie pertinente pour la discussion). Il y a eu deux approches principales pour modéliser la glycolyse dans L. lactis. La première saveur sont des variantes du modèle "Hoefnagel" [52-54], construit dans le "in silico-cell", ce qui signifie que tous les paramètres du modèle sont basés sur la cinétique enzymatique obtenue in vitro[55]. Les équations de vitesse paramétrées pour toutes les enzymes sont ensuite rassemblées pour calculer le comportement de l'ensemble de la voie, en termes de niveaux de métabolites et de flux. Aucun ajustement n'est impliqué dans les données et les prédictions du modèle sont comparées pour identifier principalement les anomalies structurelles dans le modèle. La seconde approche est basée sur l'ajustement de données de séries chronologiques de métabolites, presque exclusivement in vivo Données RMN du groupe de H. Santos [56, 57]. Dans cette dernière approche, aucune équation de vitesse biochimiquement réaliste n'est utilisée, mais des cinétiques approchées (au format loi de puissance) avec moins de paramètres et d'attributs mathématiques qui les rendent plus faciles à manipuler, notamment par le fait que les équations différentielles ont des solutions analytiques [58 ]. Récemment, une troisième approche a été présentée et comparée à la modélisation en loi de puissance : cette approche, basée sur la théorie dite du budget dynamique, fonctionne à un niveau d'abstraction beaucoup plus élevé [59]. L'étude présente des similitudes avec la perspective économique de la croissance cellulaire que nous présentons [60], mais elle a moins de détails biochimiques que les deux approches principales discutées ici, et n'aide donc pas à expliquer les mécanismes ou à identifier des cibles potentielles pour l'ingénierie métabolique.

Métabolisme primaire de L. lactis avec les principaux acteurs abordés dans le texte principal. Indication de la rétroaction réglementaire (positive) et des boucles d'anticipation qui impliquent F16bP dans la ligne orange pointillée. En rouge sont les enzymes de la Las-opéron. Dans les cases vertes, le système PTS et GAPDH, respectivement. Les pools G6P et PEP indiquent des pools d'intermédiaires considérés en équilibre rapide.

Les deux approches ont leurs avantages et leurs inconvénients. L'approche Hoefnagel est plus proche de la biochimie et de l'intuition biologique, mais souffre de données cinétiques insuffisantes (par exemple, de nombreuses cinétiques enzymatiques ont été incluses pour d'autres organismes que L. lactis) et le potentiel in vivoin vitro des différences inévitables et difficiles à traiter. De plus, les cinétiques enzymatiques sont généralement extraites de bases de données telles que Brenda ou Sabio-RK [61], dans lesquelles les conditions de dosage pour chaque enzyme sont susceptibles d'être différentes. Cela touche à une question importante de normalisation et de documentation que nous aborderons à la fin de cette section. Ces limites à in vitro la cinétique aboutit à des valeurs de paramètres plutôt incertaines, mais aucune analyse de sensibilité complète (globale) n'a été présentée à notre connaissance pour déterminer quels paramètres du modèle ont un effet important sur la dynamique et le contrôle de la glycolyse. Compte tenu de ces limitations, la correspondance entre les modèles et les données expérimentales est étonnamment bonne, et elles constituent une base solide pour affiner davantage les modèles et comprendre la base biochimique du métabolisme primaire dans L. lactis.

L'approche d'ajustement des données, ou ingénierie inverse, telle que pratiquée en particulier par Voit et ses collègues [56, 57], a un fondement thermodynamique [56, 58] mais présente l'inconvénient qu'il n'y a pas de correspondance claire avec la biochimie. Les simplifications permettent une solution analytique des équations différentielles ordinaires qui composent la plupart des modèles cinétiques. C'est potentiellement un grand avantage pour obtenir un aperçu plus approfondi de la façon dont une conception ou un ensemble de paramètres particulier affecte le comportement de la voie. Un exemple récent en L. lactis exploite cela en utilisant une approche similaire, non pas avec une cinétique de loi de puissance mais avec une cinétique linlog qui rend également des solutions analytiques à l'ensemble des équations du bilan de masse [62].

La principale découverte, à notre connaissance, résultant de l'analyse d'ingénierie inverse est l'importance de l'activation anticipatrice de F16bP sur PK. Cette boucle d'anticipation est prétendument nécessaire pour l'augmentation rapide de la PEP lors de l'épuisement du glucose [57]. Étant donné que la PEP est le substrat du système PTS qui absorbe le glucose, l'augmentation de la PEP a été rationalisée en tant que stratégie pour assurer une absorption rapide du glucose à nouveau disponible. En fait, Hoefnagel et al ont déjà fait une observation similaire dans leur en silicium modèle cellulaire [53]. Ils ont également proposé que l'activation de F16bP, mais aussi les effets du phosphate inorganique (Pi) sur la PK et la régulation de la PFK par la PEP sont importants pour une augmentation de la PEP et un épuisement lent de F16bP.

Soutenu par des preuves expérimentales, Hoefnagel [53] a souligné l'importance de Pi en tant que variable libre, plutôt qu'une variable d'entrée utilisée par Voit [57]. Cependant, il n'a pas mentionné ce que nous pensons être la conséquence la plus importante de considérer Pi comme une variable libre : cela rend le pool total de phosphate dans la cellule comme un pool conservé. Ceci est causé par ce qu'on appelle la conservation des fragments [63] : puisqu'il n'y a pas de transport net de phosphate dans les modèles (le glucose entre et les acides sortent), et les cellules ne peuvent pas fabriquer de phosphate. de novo (à moins que, de manière inattendue, ils soient capables de réactions nucléaires), la quantité totale de phosphate contenue dans tous les métabolites tels que PEP, F16bP, ATP et Pi, ne peut pas changer (d'autres conservations de fractions sont par exemple le pool total de coenzyme A, ou la somme de NADH et NAD). Notez que ces conservations de fragments peuvent être des artefacts de modèles puisque nous ignorons les sources potentielles et les puits, tels que le polyphosphate, mais ces flux sont probablement lents par rapport au flux glycolytique élevé. Par conséquent, si la cinétique du modèle est telle que F16bP chute à cause de l'épuisement du glucose, les phosphates associés Ha ve aller à d'autres piscines, notamment PEP et Pi. La question est donc de savoir quels sont les paramètres cinétiques les plus importants qui provoquent le changement de distribution du phosphate sur les pools glycolytiques, l'ATP et le Pi. Cela n'a pas encore été entièrement résolu, et donc l'affirmation selon laquelle l'activation anticipatrice de PK par F16bP est pertinente à cet égard, est à notre avis toujours en suspens.

A noter par ailleurs, que la boucle d'anticipation F16bP sur PK n'est en aucun cas unique pour L. lactis. La plupart, sinon toutes les voies glycolytiques présentent cela (plus de 30 cas dans la base de données Brenda), notamment les organismes qui n'ont pas de système d'absorption du glucose PTS et, par conséquent, ne comptent pas sur des niveaux élevés de PEP pour « démarrer » la glycolyse sur le glucose re -une addition. Ainsi, on peut s'interroger sur l'interprétation fonctionnelle de l'activation feed-forward dans d'autres organismes. Une hypothèse que nous avons est liée à la cinétique et à la thermodynamique de la GAPDH : cette enzyme fonctionne près de l'équilibre et est très sensible à l'action de masse [64]. Des niveaux élevés de F16bP indiquent probablement un flux élevé (comme dans E. coli[65]) et signalent donc qu'une activité (plus) élevée de GAPDH est requise. La boucle d'anticipation sur la PK devrait aider à tirer sur les métabolites dans la glycolyse inférieure, réduisant ainsi les produits de GAPDH. Ce dernier scénario correspond à l'étude des inhibiteurs de GAPDH [66], montrant que l'activité de GAPDH exerce un contrôle élevé sur le flux glycolytique. Notons que ce résultat n'est en fait pas en contradiction avec l'étude du groupe de PR Jensen dans laquelle ils ont montré que la variation de l'expression de la GAPDH n'affectait pas le flux glycolytique [67] : ces études ne mesurent pas strictement le coefficient de contrôle métabolique , comme expliqué dans la section sur l'optimalité.

Outre la boucle d'anticipation, il existe une autre boucle de régulation importante dans le système glycolytique dans L. lactis qui n'a pas reçu l'attention que nous pensons mériter : le retour négatif de F16bP (et Pi) sur le système PTS. Au sein du système PTS chez les Gram positifs, la protéine HPr a un double rôle : lorsqu'elle est phosphorylée au niveau du résidu His-15, elle permet le transfert de groupes phosphate dans la chaîne des événements de phosphorylation qui conduisent à l'absorption et à la phosphorylation du glucose. Cependant, lorsqu'elle est phosphorylée au niveau du résidu Ser-46, HPr agit comme un intermédiaire de signalisation dans la répression du glucose, activant CcpA [68]. Ce dernier état de HPr est favorisé par F16bP et n'est pas disponible dans le processus de transport, constituant ainsi une rétroaction négative médiée par F16bP sur l'absorption du glucose [69]. Des études chez la levure et une analyse comparative des conceptions glycolytiques suggèrent fortement que cette rétroaction est essentielle pour la robustesse contre les changements soudains de la disponibilité du glucose [69]. Ce retour d'expérience devrait également être pertinent pour évaluer les effets potentiels du PEP sur le système PTS et le redémarrage de la glycolyse : les efforts de modélisation [54] portant sur l'effet du pH ont suggéré que cet effet du PEP pourrait expliquer l'effet négatif d'un pH bas sur le flux glycolytique, mais cela a été évalué sans prendre en compte l'effet potentiellement neutralisant du F16bP (car le F16bP était également plus faible au pH le plus bas, mais sans prendre en compte [54]).

Enfin, l'un des comportements les plus complexes L. lactis la glycolyse qui réclame une explication mécaniste – toujours – est le « commutateur » (souvent progressif) entre la fermentation homolactique et la fermentation acide mixte, c'est-à-dire le fait que L. lactis présente une fermentation acide mixte (acétate, éthanol et formiate comme produits principaux) à de faibles taux de dilution dans le chémostat, et une fermentation homolactique à des taux de dilution élevés (voir [70] pour un exemple clair). La « cause finale » de ce changement sera discutée dans la prochaine section sur l'optimalité, mais le mécanisme du changement (« cause efficace ») a également été largement débattu dans la littérature, comme examiné précédemment [48]. Du point de vue des systèmes, il y a deux points à faire.

Premièrement, il est essentiel d'être précis et de faire la distinction entre contrôle et régulation, car cela a beaucoup brouillé la littérature. Dans l'analyse du contrôle métabolique, le contrôle signifie que la capacité d'une activité enzymatique à modifier un flux ou une régulation de la concentration est la manière dont le flux ou la concentration est réellement modifié [refs]. Par exemple, dans L. plantarum La demande d'ATP a un certain contrôle sur le flux [72] : cela signifie qu'avec l'augmentation du taux de demande d'ATP, le flux glycolytique augmente. Comment ce changement est provoqué, c'est le domaine de la régulation : il dépend de la façon dont le réseau de régulation « joue les boutons de contrôle du métabolisme ». Donc, si l'on déclare que "le rapport NADH/NAD détermine le changement", cela signifie probablement que les réactions qui affectent le rapport NADH/NAD ont un contrôle sur le rapport de flux de lactate à acétate, passant par le rapport NADH/NAD. Nous pensons que cette dernière affirmation est beaucoup plus précise et donne lieu à moins de confusion et à une meilleure conception des expériences pour prouver ou infirmer cela. Nous pensons que la biologie des systèmes et ses définitions théoriques précises concomitantes ont beaucoup à offrir à cet égard.

Deuxièmement, le changement est très probablement le résultat d'un certain nombre de rétroactions et d'interactions régulatrices allostériques qui ont lieu simultanément, et donc un modèle est garanti qui peut quantifier les contributions des différents mécanismes. Cet impact n'est pas susceptible de changer avec les conditions, et donc la question « qu'est-ce qui cause le changement ? » est probablement la mauvaise question à poser. Nous développons un modèle cinétique qui prend in vitro la cinétique comme base et utilise des données de séries chronologiques expérimentales pour mettre à jour ou ajuster les paramètres. Par la suite, une analyse de sensibilité globale des paramètres devrait être appliquée pour évaluer leur impact à la lumière de leur incertitude, et pour évaluer quels paramètres affectent le flux et le commutateur. Nous pensons que c'est la meilleure approche pour aborder cette importante observation physiologique.

L'optimalité comme explication de la régulation

La distinction faite entre les différents types de causes explicatives par Aristote est toujours applicable en biologie. En particulier, il est important de distinguer les causes efficientes et finales (causa efficiens et cause finalis) en biologie moléculaire moderne. Les causes efficaces sont, par exemple, les détails moléculaires des mécanismes de régulation passifs ou actifs qui conduisent à un certain comportement. La cause ou la fonction finale apparente de tels mécanismes de régulation est la survie et la réplication efficaces des organismes dans lesquels ils agissent. Darwin avait déjà remarqué que cette cause finale, comme il l'appelle aussi, est programmée par le mécanisme de la sélection naturelle [73]. Par conséquent, lorsque les détails des mécanismes de régulation ont été révélés par la recherche en biologie moléculaire, la quête scientifique n'est pas terminée. Il reste la question pertinente de savoir si ce mécanisme sert efficacement la survie et la réplication. Et par « efficace », nous entendons d'une manière presque optimale compte tenu des outils dont l'organisme dispose, puisque la deuxième conséquence de la sélection naturelle est que l'aptitude de l'organisme à servir la survie et la réplication sera améliorée jusqu'à ce que certains type d'utilisation maximale des ressources disponibles est atteint. La réponse à cette question n'est souvent pas si facile à donner, en raison des interactions compliquées des composants au sein de l'organisme et entre l'organisme et son environnement, ainsi que de l'obscurité de la façon dont l'aptitude, ou le succès de la réplication et de la survie est déterminé dans l'environnement biotique et abiotique souvent dynamique. La biologie des systèmes peut jouer un rôle dans la compréhension de la relation entre les causes efficientes et finales, comme nous tenterons de l'illustrer. Le type de modèles utilisés dans de telles recherches n'est généralement pas des plus complets (une fois salués).in silico cell » [55], mais beaucoup plus basique et plus facile à comprendre, bien que donnant souvent des résultats surprenants.

On peut s'attendre à ce que l'utilisation optimale des ressources disponibles soit plus facile à comprendre pour les organismes qui se répliquent dans des environnements relativement simples, de nature constante et homogène et avec des concurrents de leur propre famille uniquement. Le microbiologiste pense immédiatement à une culture pure au chémostat ou propagée par transfert en série en milieu constant. Il a été montré qu'il est possible de comprendre les aspects du métabolisme central chez des organismes sélectionnés dans de telles conditions dans une perspective d'utilisation optimale des ressources. Un bel exemple a été donné par Ibarra et al.[74] où il a été montré que lors du transfert en série E. coli s'adapte à travers des mutations à la croissance sur le glycérol, et que les mutants ont convergé vers un profil métabolique qui pourrait être prédit à partir des principes d'optimalité en utilisant FBA. Dans ce cas, l'optimalité de la fitness a été supposée correspondre à un taux de synthèse de biomasse maximal à un taux d'absorption de glycérol limité. Par conséquent, il semblait que FBA était capable d'expliquer les profils métaboliques centraux en utilisant des hypothèses sur la cause finale de la régulation métabolique dans les conditions données, c'est-à-dire la production de biomasse. Cependant, dans le même article, il a été montré que la FBA n'a pas réussi à prédire le profil métabolique de E. coli croissance sur glucose, en particulier la production d'acétate à des concentrations élevées de glucose. De même, l'analyse FBA sur un modèle à l'échelle du génome de L. plantarum a prédit un profil de fermentation acide mixte en toutes circonstances, au lieu de la production de lactate observée expérimentalement [15]. Fait intéressant, aussi pour L. plantarum l'adaptation au glycérol est apparue prévisible par FBA. L'échec du FBA à prédire l'adaptation dans des conditions de glucose suggère que le FBA manque peut-être d'éléments essentiels qui sont importants pour expliquer une croissance optimale sur des sources de carbone abondantes et riches en énergie. En fait, toute utilisation énergétiquement inefficace du substrat, parfois appelée « métabolisme de débordement », ne devrait pas se produire à aucun moment par FBA, à moins que ad hoc des contraintes de capacité sur certaines voies métaboliques sont imposées. Ce type de métabolisme est cependant si abondamment observé chez les micro-organismes [70, 75-78] qu'il est difficile de croire qu'il ne résulte pas de la maximisation de la fitness.

En nous concentrant sur les bactéries lactiques ici, nous voyons qu'une caractéristique importante des bactéries lactiques est qu'elles produisent principalement de l'acide lactique à partir de sucres. Dans un certain nombre de cas comme dans L. lactis, la fermentation acide mixte est observée à faible disponibilité de substrat ou pendant la croissance sur des sucres qui conduisent à un faible taux de croissance [70, 75]. Cependant, d'autres espèces comme L. plantarum afficher une fermentation acide mixte uniquement à une disponibilité de substrat extrêmement faible [15]. Tout cela, malgré le fait que la fermentation acide mixte donne un ATP supplémentaire par molécule de glucose. A la question pourquoi les LAB produisent de l'acide lactique dans certaines conditions et des acides mélangés dans d'autres, il existe des réponses dans la littérature indiquant qu'il s'agit des concentrations de NADH/NAD, ATP/ADP ou fructose-bisphosphate et triose phosphate ou leur rapport au phosphate libre. , ainsi que des publications indiquant que c'est le niveau de PFL ou de LDH qui détermine le choix [70, 75, 79-82]. Mais quel que soit le mécanisme par lequel le choix entre un métabolisme efficace et inefficace est fait, la question reste de savoir pourquoi les bactéries lactiques choisissent de toute façon une voie énergétiquement inefficace.

Il semble que l'utilisation d'une branche de fermentation acide mixte présente plus d'inconvénients qu'un ATP supplémentaire ne pourrait compenser. On ne sait pas immédiatement quels pourraient être ces inconvénients. Il existe plusieurs hypothèses pour expliquer pourquoi les bactéries lactiques produisent de l'acide lactique alors qu'elles disposent d'une voie énergétiquement plus efficace. Une hypothèse affirme qu'il s'agit d'une sorte de guerre chimique, où d'autres organismes en compétition pour les mêmes ressources sont inhibés dans leur croissance par des concentrations élevées de lactate. Une hypothèse similaire a été proposée pour expliquer la production d'alcool par la levure [83]. Les produits finaux, alcool ou lactate, sont produits dans le cadre d'un effort collectif de la population. Les individus paient cette guerre par la perte virtuelle d'ATP qui aurait pu être gagnée dans la branche acide mixte, dans le cas des LAB, ou dans la phosphorylation oxydative dans le cas des levures. Le problème avec cette hypothèse est que l'on pourrait s'attendre à ce que dans les cultures pures, des mutants « tricheurs » apparaissent qui utilisent exclusivement les voies écoénergétiques. L'hypothèse implicite dans les hypothèses de guerre est à savoir que ces mutants auraient une meilleure aptitude que le type sauvage, car ils utilisent leur substrat plus efficacement. Ils profiteraient donc de la guerre menée par d'autres sans y investir.Lorsque le besoin de guerre chimique disparaît, comme dans les populations de laboratoire d'une seule espèce, les mutants tricheurs économes en énergie devraient même prendre complètement le contrôle de la population. Cependant, rien n'indique que de tels déserteurs métaboliques existent dans les populations microbiennes de laboratoire.

Il y a quelque temps, nous avons publié une hypothèse dans laquelle nous proposions que plusieurs caractéristiques globales des micro-organismes, comme le métabolisme de débordement, pourraient être le résultat de la maximisation du taux de croissance [60]. Pour l'hypothèse, nous avons supposé que la bonne allocation des ressources cellulaires détermine le taux de croissance. Le résultat des calculs sur un modèle d'auto-réplicateur a montré que parfois des effets contre-intuitifs surviennent. L'idée de base derrière le modèle était que les voies générant de l'ATP supplémentaire sont généralement plus longues ou nécessitent plus d'enzymes. Ainsi, dans le cas des LAB, bien que de l'ATP supplémentaire soit obtenu à partir de la fermentation acide mixte, par rapport à la fermentation homolactique, au moins cinq enzymes supplémentaires sont nécessaires pour générer cet ATP. La rentabilité d'un tel investissement dépend des conditions environnementales, notamment de la concentration du substrat, ou plus précisément de l'investissement réalisé pour accumuler le substrat. La prédiction de ce modèle est qu'à des concentrations élevées de substrat, une croissance plus rapide est réalisable avec des voies métaboliquement moins efficaces. De plus, un changement clair dans l'allocation des protéines aux différentes branches est prédit, ce qui signifie que le changement dans l'utilisation des voies devrait s'accompagner d'un changement dans l'expression des gènes correspondants, car l'investissement dans les protéines de ces voies impose un coût sur la forme physique. (voir la discussion ci-dessous sous "Signatures d'optimalité»). Des effets similaires sont prédits par des modèles dans le cadre FBA lorsqu'une contrainte d'encombrement est imposée sur la quantité totale d'enzymes [84]. En effet, il existe des observations selon lesquelles de tels changements s'accompagnent de changements dans l'expression des gènes, par exemple dans E. coli, S. cerevisiae et B. subtilis[77, 78, 85-87]. Dans des expériences de chemostat avec L. lactis différentes observations ont été faites. Dans L. lactis ML3, l'activité spécifique de la LDH a augmenté avec l'augmentation des taux de croissance et des concentrations de substrat, mais les auteurs ont mentionné des différences notables entre les souches dans le comportement de changement [70]. Des expériences plus récentes sur L. lactis L'IL1403 où la protéomique a été utilisée pour mesurer les concentrations relatives de protéines dans les cellules cultivées à différents taux de dilution a montré que le niveau de LDH est relativement constant, mais que les ratios de protéines dans la branche acide mixte diminuaient avec l'augmentation du taux de croissance et de la concentration du substrat [88, 89]. Ainsi, bien que nous ne puissions pas expliquer l'activité constante de la LDH (le fait que la LDH soit dans le Las-opéron dans L. lactis[90] n'aide pas beaucoup, car ce n'est pas dans le très homolactique L. plantaru m [91]), il y a des indications que le compromis entre l'investissement dans les protéines de la voie acide mixte et le bénéfice de la génération supplémentaire d'ATP pourrait jouer un rôle dans la détermination du changement métabolique.

Signatures d'optimalité

Plusieurs publications peuvent être trouvées dans la littérature qui montrent des preuves d'optimalité des niveaux d'expression des protéines dans les micro-organismes. Par exemple, Dekel et Alon ont montré dans une expérience évolutive que le niveau de protéine β-galactosidase dans E. coli s'adapte rapidement aux concentrations de lactose dans le milieu. Lorsque les cultures sont transférées en série sur des milieux contenant une concentration fixe en lactose, des mutants apparaissent avec une expression adaptée de la lacZ gène [92]. Un niveau d'expression réglé de manière optimale est un compromis entre le coût d'expression de la protéine β-galactosidase, qui augmente avec l'augmentation du niveau de protéine, et le bénéfice de son activité qui augmente avec l'augmentation des concentrations de lactose. Dekel et Alon ont déduit le coût et l'avantage des niveaux de β-galactosidase à différentes concentrations de lactose directement en termes d'effets sur le taux de croissance. Dans la configuration expérimentale utilisée, le taux de croissance était une composante importante de la condition physique. La sélection sur les taux de croissance maximaux à la concentration de lactose donnée et le compromis entre le coût et le bénéfice sur le taux de croissance a donné lieu à la sélection de mutants avec un niveau d'expression croissant de lacZ à des concentrations plus élevées de lactose dans le milieu. La stabilisation des niveaux d'expression s'est produite après 300-500 générations. Cet exemple a montré que la pression de sélection sur l'expression optimale d'une protéine, s'élevant à peut-être 3 % de la protéine totale, peut être très forte (10 000 tétramères par cellule, 116 KDa par sous-unité, et une cellule se développant à un temps de doublement de 40 min. contient 235 fg de protéine, Bionumbers 102019 et 104879 [93]).

Une série d'expériences du groupe de P.R. Jensen à l'Université technique du Danemark, montre une signature de niveaux d'expression optimaux dans L. lactis et E. coli types sauvages. Par exemple, lorsque le taux de croissance de E. coli est mesurée à différents niveaux d'expression du gène proton-ATPase, le taux de croissance maximal est observé exactement au niveau de type sauvage [94]. D'autres articles de ce laboratoire décrivent une propriété similaire pour d'autres enzymes glycolytiques dans L. lactis, comme LDH, PFK, PK, PGM, PGE, GAPDH, ainsi que l'activité de l'ensemble Las opéron [95–97, 67]. Pour tous les gènes correspondants, il a été trouvé que le taux de croissance maximal ou les taux glycolytiques étaient observés au niveau d'expression de type sauvage. Interprétant ces résultats dans le cadre de l'analyse du contrôle métabolique, les auteurs concluent que ces enzymes n'ont aucun contrôle sur la vitesse de croissance ou sur la vitesse glycolytique, ou techniquement que les coefficients de contrôle de flux des enzymes sur ces processus sont nuls. Ceci est surprenant, car dans le cadre de l'analyse du contrôle métabolique, le théorème de sommation des coefficients de contrôle dit que la somme des coefficients de contrôle doit être 1. Ou en d'autres termes, le contrôle doit résider dans une autre enzyme, ou être réparti sur plusieurs enzymes. Cependant, du point de vue de l'optimisation, il est facile de comprendre les résultats, en particulier en ce qui concerne le manque de contrôle sur le taux de croissance, lorsque le taux de croissance est une entité qui détermine la fitness dans une large mesure et a été optimisée au cours de l'évolution. L'expression optimale d'une enzyme correspond exactement au niveau auquel elle ne devrait avoir aucun contrôle sur le taux de croissance. Cela semble être en conflit avec le théorème de sommation [98], mais ce n'est pas le cas si l'on admet qu'il peut être impossible de mesurer de vrais coefficients de contrôle de flux dans des systèmes à régulation active (voir «Dans l'état optimal, les coefficients de contrôle de flux apparents in vivo sont égaux à 0»). Le coefficient de contrôle d'une enzyme est défini comme le rapport des changements relatifs d'un flux sur le changement relatif de cette enzyme, sans que des changements se produisent dans les autres enzymes. Cette dernière condition ne peut pas être garantie dans les systèmes vivants, car ils peuvent adapter les quantités d'autres enzymes en réponse à des changements induits expérimentalement dans une enzyme cible.

Dans l'état optimal, les coefficients de contrôle de flux apparents in vivo sont égaux à 0

Le coefficient de contrôle du flux d'une enzyme sur un flux de voie est défini comme l'effet relatif de la concentration de l'enzyme sur le flux métabolique à travers la voie. Pour énoncer cela en termes mathématiques, supposons que nous ayons un chemin avec N différentes enzymes E je, où je est un indice pour les différentes enzymes allant de 1 à N. Le flux métabolique J par la voie dépend des concentrations e je des enzymes E je, c'est-à-dire qu'elle est fonction de ces concentrations. Alors le coefficient de contrôle de flux de E je est défini comme [99] :

Si nous voulons mesurer expérimentalement le coefficient de contrôle de l'une des enzymes sur le flux dans la voie, alors nous pourrions faire varier la concentration de cette enzyme et mesurer les changements résultants dans le flux. Pour mesurer le coefficient de contrôle de cette enzyme, aucun changement dans les concentrations des autres enzymes n'est autorisé (c'est ce que la différenciation partielle ∂J / ∂e je indique). Il s'agit d'une condition importante qui ne sera probablement pas remplie dans les systèmes vivants, comme nous le verrons ci-dessous (et illustré à la figure 2).

Illustration de la différence entre la mesure de flux dans des systèmes sans et avec contraintes réglementaires. Le flux dans une voie avec deux enzymes Michaelis-Menten irréversibles a été calculé. La quantité de la première enzyme e1 a varié soit indépendamment de e2, comme il se doit pour mesurer son coefficient de contrôle, ou dans un système dans lequel la quantité totale d'enzyme e1 + e2 est contraint. Dans ce dernier système, une distribution optimale des enzymes est observée à e1 = 0,4. Au voisinage de cet optimum e1 n'a aucun contrôle apparent sur le flux (ni e2). Équations de taux et valeurs des paramètres utilisées : v1 = k1e1(S/K S)/(1 + (S/K S) + (X / K SK IX))v2 = k2e2X / (K X + X) k1 = 2, k2 = 1, K S = 1, K IX = 5, K X = 2, et S = 5.

Le problème de base de l'optimisation est de répartir une ressource limitée sur un certain nombre de composants de manière à optimiser certaines fonctions des composants. Dans le cas des voies métaboliques, la ressource limitée pourrait être la quantité totale de protéines présentes dans les enzymes. Ensuite, l'ajout d'un peu d'une enzyme serait automatiquement compensé par le système en déduisant la même quantité totale de protéines d'une ou plusieurs autres enzymes. Dans le cas d'organismes vivants, de telles limitations pourraient résulter de l'espace limité à l'intérieur des cellules [84], ou de la limitation par la capacité totale des ribosomes ou, en supposant que la quantité de ribosomes puisse être adaptée, d'une limitation par de multiples contraintes physiques sur le soi complet. -la machinerie de réplication, qui est essentiellement le système de tous les composants d'une cellule [60]. Il est maintenant clair que les coefficients de contrôle ne peuvent pas être déterminés dans une telle cellule à partir des observations de la quantité de l'enzyme manipulée uniquement. Lors de la manipulation expérimentale de la concentration d'une enzyme, la cellule compensera automatiquement cette perturbation en modifiant les concentrations d'autres enzymes. Si nous supposons qu'autour du niveau d'enzyme dans le type sauvage, la régulation des concentrations d'enzymes est optimale, de sorte que le flux maximal est obtenu, alors tout petit changement dans une enzyme sera compensé exactement par des changements dans une ou plusieurs des autres enzymes, conduisant à des coefficients de contrôle apparents égaux à zéro (comme le montre également la figure 2).

Un exemple simple peut être déduit d'un résultat théorique de Klipp et Heinrich dans [100] où la quantité totale de protéines dans une voie linéaire a été prise comme ressource limitante. Les auteurs ont montré que si cette ressource est utilisée de manière optimale pour atteindre un flux maximal à travers la voie, alors les coefficients de contrôle de flux sont égaux aux concentrations fractionnaires d'enzymes, c'est-à-dire où e tot est la quantité totale de protéines. En réécrivant cette équation en utilisant la définition de , nous avons dans l'état optimal, c'est-à-dire lorsque J = Jmax:

Si l'organisme régule de manière optimale la distribution de ses ressources dans cet état, alors tout changement e k dans la concentration e k d'une enzyme E k sera compensé par un changement total –e k dans les autres concentrations enzymatiques de sorte que et e tot reste inchangé. Par conséquent, la variation nette de flux J résultant d'un changement technique e k et les changements induits dans les autres enzymes sont par approximation du premier ordre

Ainsi, bien que les coefficients de contrôle de flux individuels puissent ne pas être nuls, l'effet d'une régulation optimale, en compensant les effets de coût de la manipulation d'une enzyme particulière conduit à un effet net de disparition J sur le flux J. En d'autres termes, en raison de la régulation optimale innée de l'expression enzymatique, les vrais coefficients de contrôle ne peuvent pas être évalués expérimentalement si seulement J et e k sont mesurés dans l'expérience. Le coefficient de contrôle apparent sera égal à zéro, même si les vrais coefficients de contrôle diffèrent de zéro (Fig 2).

Bien que cet effet ne soit valable que pour un flux optimisé sur le plan de l'évolution, qui en cas de croissance est le taux de synthèse de biomasse, tout flux étroitement lié à la synthèse de biomasse, comme la production d'ATP ou le flux glycolytique, peut se comporter de manière similaire. . Ainsi, les travaux fondateurs du groupe de P.R. Jensen ne doivent pas être considérés comme un échec à déterminer où se situe le contrôle de la glycolyse, mais comme une preuve importante que L. lactis la glycolyse a en effet été optimisée en ce qui concerne les niveaux d'enzymes. On peut conclure que les tentatives pour augmenter le flux glycolytique, ou le taux d'acidification (une combinaison de flux et de taux de croissance) dans L. lactis est voué à l'échec. La perspective économique des stratégies de croissance cellulaire, y compris les modèles conceptuels et la théorie esquissée ci-dessus, permet de tester des scénarios dans lesquels encore plus de ressources peuvent être allouées à la glycolyse. Ces activités pourraient être renforcées par des études de diversité des souches, dans lesquelles les différences de taux d'acidification sont criblées et mappées aux mécanismes moléculaires. Alternativement, on peut être amené à conclure que L. lactis a en effet atteint les limites physiques de son appareil biologique, ce qui peut être quelque peu décevant, mais utile à savoir. Ces limites sont néanmoins susceptibles de dépendre des conditions environnementales, en particulier si celles-ci sont dynamiques dans la composition en éléments nutritifs et les espèces concurrentes. Ainsi, ce qui est optimal dans un état est probablement sup-optimal dans un autre, et c'est encore un territoire assez inexploré en biologie des systèmes microbiens. En particulier, de nombreuses méthodes en biologie des systèmes, telles que FBA, ne fonctionnent que pour les monocultures dans des environnements constants, et il est urgent de passer à des (éco)systèmes plus complexes. Un cadre théorique qui traite de telles conditions est la théorie des jeux évolutionnaires, qui sera illustrée pour LAB dans la prochaine session.

Théorie des jeux évolutifs des lactocoques protéolytiques coopérants et d'autres jeux

Lactococcus lactis est l'une des espèces bactériennes dominantes dans de nombreuses cultures de ferments laitiers [101, 102]. Les souches d'origine laitière ont généralement plusieurs auxotrophies d'acides aminés [103, 104] et dépendent donc de l'utilisation des acides aminés présents dans le milieu de croissance. Le lait de vache contient environ 3% de protéines, qui sont principalement présentes dans diverses formes de caséine. Les différents types de caséines ont une longueur d'environ 200 acides aminés et doivent être clivés en peptides avant de pouvoir être absorbés et utilisés. Les lactocoques ont une machinerie sophistiquée constituée d'une protéase extracellulaire et de systèmes de transport et de dégradation de peptides, qui leur permettent d'utiliser les protéines du lait [105]. La présence de la protéase est essentielle pour une croissance rapide dans le lait. Alors que les génomes lactococciques codent pour plusieurs peptidases et systèmes de transport de peptides [106–108], la protéase ancrée dans la paroi cellulaire est généralement codée en une seule copie sur un plasmide [109–113]. En 1931, Harriman et Hammer [114] ont d'abord décrit que les lactocoques de démarrage qui se développaient initialement rapidement dans le lait perdaient cette capacité lors d'une propagation prolongée. Ils ont attribué leurs observations à la perte d'activité protéolytique, mais ce n'est que dans les années 1970 qu'il a été découvert que la protéase était codée sur un plasmide qui était parfois perdu, donnant naissance à des mutants négatifs pour la protéase. Au cours d'une propagation prolongée, ces mutants envahissent la population protéase positive [115]. Le fait que le trait protéolytique soit très instable, alors que la présence de la protéase conduit à des taux de croissance et des rendements de biomasse significativement accrus, semblait contre-intuitif, et plusieurs études ont tenté d'aborder ce comportement paradoxal [116, 117].

Compte tenu de ces observations, une question évidente est de savoir comment un tel trait protéolytique peut évoluer et être maintenu de manière stable. Un comportement altruiste sur l'expression d'une protéase extracellulaire a été suggéré, basé sur l'observation que l'expression de la protéase dans Bacillus subtilis est hétérogène au sein d'une population clonale [118]. Un tel altruisme pourrait jouer un rôle dans la stabilisation de la protéase, mais il ne peut expliquer son évolution. Ce n'est que lorsque d'autres propriétés du système, telles que la structure spatiale, les densités cellulaires et la diffusion substrat/produit ont été prises en compte, qu'un modèle a pu être développé pour expliquer le comportement observé (Figure 3) [119]. Le modèle repose sur deux hypothèses. La première hypothèse est que l'expression de la protéase impose un fardeau sur la fitness et le taux de croissance des cellules Prt + par rapport aux cellules Prt -. La deuxième hypothèse est que dans le lait, une cellule Prt + peut absorber une fraction des produits de dégradation extracellulaire avant qu'ils ne se diffusent. Si c'est le cas dans une culture mixte de cellules Prt + et Prt -, le fardeau de l'expression de la protéase peut être compensé par la capacité à capturer plus de peptides. Cette capacité augmente avec la diminution des densités cellulaires totales et avec une fraction décroissante de cellules Prt + dans la culture (coin inférieur gauche sur la figure 3b). À des densités cellulaires élevées et/ou à des fractions élevées de cellules Prt +, la concentration en peptides dans le milieu sera suffisante pour supporter des taux de croissance élevés de souches Prt - infidèles, leur permettant d'envahir une culture Prt + (coin supérieur droit de la figure 3b) . La validité de ce modèle a été confirmée indirectement par des expériences de propagation de cultures mixtes dans le lait. Dans une approche plus directe, les auteurs ont montré une alimentation croisée de peptides dans une culture mixte à travers une série d'expériences dans lesquelles la luciférase bactérienne a été couplée à des séquences de promoteurs qui répondent aux niveaux intracellulaires d'acides aminés/peptides. En faisant varier le rapport Prt + : Prt - dans des cultures mixtes et en plaçant la construction rapporteur dans les souches Prt + ou Prt -, il a été établi qu'à de faibles fréquences de souches Prt + dans la culture, il existe une différence significative entre les acides aminés intracellulaires/ disponibilité des peptides entre les deux souches variantes, alors qu'à des fréquences élevées de souches Prt + aucune différence n'a pu être détectée.

Alimentation croisée peptidique entre les souches Prt + et Prt - dans une culture mixte des deux variantes. La protéase extracellulaire des souches Prt + clive la caséine en peptides qui diffusent loin de la cellule et peuvent être utilisées en envahissant les cellules infidèles Prt (Panneau a). La modélisation de la dynamique entre les deux souches variantes montre qu'à de faibles densités de cellules et de faibles fréquences Prt +, le gain fractionnaire après une étape de propagation est élevé pour les cellules Prt +. Si les cultures sont cultivées (ensemencées) à des densités cellulaires élevées et à des fréquences élevées de cellules Prt -, le gain fractionnaire des cellules Prt + est négatif, ce qui indique qu'elles sont supplantées par les cellules Prt - (Panneau b). Reproduit de Bachmann et. Al. 2010 avec l'autorisation de l'éditeur.

Des concepts similaires sont susceptibles d'être applicables à d'autres enzymes dégradant les substrats extracellulaires. Un exemple bien décrit est l'expression de l'invertase dégradant le saccharose dans la levure [120].Les approches théoriques des jeux ont montré qu'avec une charge croissante d'expression des biens publics, les dynamiques de population représentent respectivement une relation mutuellement bénéfique, un jeu de congères dans lequel la coexistence de coopérateurs et de tricheurs est possible ou un dilemme de prisonniers qui conduit à l'extinction des les coopérateurs [120, 121].

Les bactéries lactiques sont relativement bien étudiées en ce qui concerne leur capacité à produire des bactériocines [122, 123] et l'influence des bactériocines sur la dynamique des populations bactériennes a été étudiée en détail au cours des dernières décennies [124-126]. Les cellules productrices de bactériocines et leurs dérivés sensibles ainsi que résistants forment trois souches en interaction dont la dynamique peut également être décrite par le jeu de main pierre-papier-ciseaux. Dans un tel jeu, le producteur de bactériocine bat la souche sensible, qui bat la souche résistante qui bat la souche productrice. Des simulations mathématiques ainsi que des travaux expérimentaux ont démontré une telle dynamique pierre-papier-ciseaux [127] et par la suite, il a été démontré qu'une telle dynamique se produit également chez des souris co-cage qui ont été inoculées avec l'une des trois souches variantes [128]. Dans une étude récente, deux E. coli souches, chacune produisant un type différent de colicine ciblant l'adversaire, ont été autorisées à entrer en compétition les unes avec les autres dans divers environnements. Les auteurs ont découvert que la production de bactériocines à de faibles niveaux induisait la production de bactériocines de l'adversaire, et grâce à ce mécanisme, les souches pouvaient défendre des niches locales et coexister [129]. De manière analogue à la proposition selon laquelle les bactériocines augmentent plutôt que diminuent la biodiversité [27, 29], il a également été proposé que la prédation des phages favorise la diversité [130]. Compte tenu de ce résultat et de l'importance des bactériophages dans l'industrie laitière, leur influence sur la dynamique des populations et la stabilité des cultures pourrait devoir être reconsidérée. L'un des futurs défis, la description et la compréhension des interactions bactériennes dans par ex. les cultures starter multisouches, auront certainement besoin d'être assistées, et dans le cas idéal guidées, par des prédictions de modèles mathématiques qui devraient générer des hypothèses vérifiables.

Conclusions et perspectives

Dans cette revue, nous avons décrit comment les approches de biologie des systèmes ont contribué au domaine de la physiologie microbienne, en particulier des bactéries lactiques. Les modèles et la théorie ont été utilisés pour fournir des aperçus concis et précis des connaissances actuelles et pour généraliser les observations dans un cadre qui peut fournir une compréhension plus approfondie. Les modèles peuvent également fournir des explications sur des observations non intuitives, simplement parce que l'esprit humain ne peut pas suivre de nombreuses interdépendances, surtout si elles sont très non linéaires. La biologie des systèmes est en grande partie une physiologie quantitative, et elle est devenue, et deviendra encore plus forte à l'avenir, une approche importante en biologie en général, et en microbiologie LAB en particulier.

Dans cette optique, et comme promis, une remarque sur la question de la normalisation. La biologie des systèmes a clairement mis en évidence l'utilisation inefficace et fragmentée des ressources au sein des sciences de la vie. Chaque laboratoire utilise désormais son propre support, ses propres conditions de tampon d'analyse et la notation des données et des composants du modèle. Par conséquent, les données ne peuvent pas être facilement mises en commun à des fins de modélisation, ou pas du tout, même si la même question a été abordée dans la même souche. Si nous voulons devenir précis et quantitatifs en biologie, cela devra changer. Par exemple, nous avons trouvé des différences physiologiques substantielles entre Lactococcus lactis Les souches MG1363 utilisées dans les laboratoires néerlandais à Groningen, Amsterdam ou Ede (NIZO), probablement causées par des adaptations cumulatives à différentes histoires de culture. Pour un certain nombre de projets de biologie des systèmes aux Pays-Bas, nous avons donc développé des normes pour la cryoconservation, un milieu chimiquement défini et un tampon de dosage (et des dosages) pour toutes les enzymes glycolytiques, qui ont été adoptés par les chercheurs néerlandais actifs dans la biologie des systèmes de L. lactis. Même si nous espérons évidemment que ces normes seront acceptées par la communauté, il est plus important que nous nous mettions d'accord sur certaines normes : les avantages devraient être évidents. Cela permettra également de mieux démêler les effets causés par les conditions extérieures et par exemple la diversité génétique.

Quels sont donc les autres défis de la biologie des systèmes microbiens ? Évidemment, nous sommes loin de saisir la complexité des vraies cellules vivantes avec les modèles actuels. Les outils de génomique fonctionnelle deviennent de plus en plus quantitatifs et fournissent des ensembles de données précieux et complets sur les processus pertinents dans la cellule. Plusieurs études des groupes toulousains ont démontré que magnifiquement pour L. lactis, en particulier l'étude récente dans laquelle la stabilité des protéines et des ARNm a été modélisée sur la base des données du transcriptome et du protéome [89, 131]. Des couches supplémentaires de complexité, du monde de l'ARN ou des modifications post-traductionnelles, doivent encore être divulguées, mais les techniques se développent rapidement pour le faire de manière quantitative également.

Outre les composants et interactions supplémentaires, nous constatons également une nette tendance vers les technologies à cellule unique. A ce niveau, nous observons que le bruit et l'hétérogénéité sont des facteurs cruciaux à inclure dans notre compréhension du phénotype [132]. De tels effets stochastiques, causés par de faibles nombres de copies de composants cruciaux (il n'y a qu'une seule molécule d'ADN, ou peut-être deux [133]!), prise de décision cellulaire dans, par exemple compétence ou sporulation dans Bacillus subtilis[132], les stratégies de pari et l'hétérogénéité de survie des stress. Les technologies s'amélioreront rapidement qui nous permettront de quantifier de plus en plus de propriétés au niveau d'une seule cellule en utilisant la microfluidique, l'imagerie quantitative ou la cytométrie en flux. Ces développements nécessiteront un état d'esprit différent, et des outils de modélisation concomitants prenant en compte la nature stochastique des processus cellulaires.

Enfin, nous devons combler le fossé entre les processus cellulaires et la dynamique des populations dans les communautés. Le séquençage de ces populations et communautés est devenu abordable, donnant naissance au domaine de la métagénomique et aux premiers pas dans la direction de la métatranscriptomique et de la métamétabolomique. Évidemment, pour les LAB et leurs applications, ces développements sont extrêmement pertinents. Nous avons discuté de la façon dont les approches théoriques des jeux peuvent aider à comprendre les principes généraux et les forces en jeu dans les populations, donnant lieu à des dynamiques phénotypiques souvent non intuitives. À un niveau plus moléculaire, nous avons seulement commencé à gratter la surface des composés impliqués dans les interactions, des technologies pour mesurer les flux de communauté [134] et des approches de modélisation pour s'adapter à une telle compréhension de la dynamique de la communauté. Pour illustrer : les outils bien établis pour la modélisation métabolique à l'échelle du génome ne fonctionnent que pour les monocultures homogènes. Comment décrirait-on l'objectif d'une communauté ? Il n'y a que très peu d'exemples dans la littérature qui traitent de cette question [135-137]. Nous sommes les pionniers de ce type de questions et de l'utilisation de modèles métaboliques à l'échelle du génome (qui sont les plus proches des données métagénomiques), dans les LAB à travers le consortium du yaourt de Lactobacillus bulgaricus et Streptocoque thermophilus. Nous attendons des efforts et des percées majeurs dans le sens d'un lien entre la physiologie microbienne et la modélisation de la dynamique des populations et les théories écologiques.


Cinétique enzymatique et MCA : les coefficients d'élasticité

Dans la section précédente, les coefficients de contrôle ont été décrits. Ce sont des propriétés du système dans son ensemble, qui quantifient le contrôle exercé par chaque enzyme sur un certain flux de voie (ou concentration en métabolites). Qu'en est-il du grand nombre de données recueillies par les cinétiques enzymatiques tout au long de ce siècle ? Il serait utile de fusionner ces données avec le formalisme MCA pour caractériser les propriétés de contrôle des voies métaboliques. Cette section du Web MCA décrit comment les données cinétiques des enzymes isolées peuvent être converties en coefficients d'élasticité. La section suivante traite de la façon dont on peut utiliser le coefficients d'élasticité pour calculer les coefficients de contrôle.

Cinétique enzymatique

En cinétique enzymatique, on s'intéresse à la caractérisation de la progression des réactions catalysées par les enzymes dans la dimension temporelle. Une façon de le faire est de suivre l'apparition d'un des produits de la réaction ou la disparition d'un des substrats. Des courbes telles que celle de la figure 2 sont typiques.

Plus fréquemment, cependant, le comportement cinétique d'enzymes isolées est étudié à travers l'étude de la dépendance des vitesses initiales de réaction avec la concentration du ou des substrats. La figure 3 montre un exemple typique d'une telle relation.

Les études de cinétique enzymatique sont centrées sur la détermination de paramètres cinétiques tels que les constantes de Michaelis ou les vitesses limites (voir figure 3) ou (plus rarement) sur les constantes de vitesse élémentaires d'un mécanisme réactionnel spécifique. Voir Cornish-Bowden (1979) ou Keleti (1986) pour plus d'informations sur la cinétique enzymatique.

Coefficients d'élasticité

Dans l'analyse du contrôle métabolique, les propriétés de chaque enzyme (isolée) sont mesurées d'une manière très similaire à celle des propriétés de contrôle du flux : en utilisant une sensibilité, connue sous le nom de coefficient d'élasticité (Kacser & Burns 1973, Heinrich & Rapoport 1974, Burns et al. 1985). Dans ce cas, il faut considérer l'effet des perturbations d'un paramètre de réaction sur le local taux de réaction. Par local, on entend que cette sensibilité fait référence à la réaction isolée qui a les mêmes caractéristiques (concentrations en effecteur et en enzyme, température, etc.) que dans l'ensemble du système au point de fonctionnement (état stationnaire) d'intérêt. Les coefficients d'élasticité sont définis comme le rapport du changement relatif du taux local au changement relatif d'un paramètre (normalement la concentration d'un effecteur). Infinimentimal, cela s'écrit :

vi est le taux de l'enzyme en question et p est le paramètre de la perturbation. Chaque enzyme a autant coefficients d'élasticité que le nombre de paramètres qui l'affectent. On peut reconnaître immédiatement la concentration des substrats de réaction, des produits et des effecteurs comme paramètres de la réaction.

Contrairement aux coefficients de contrôle, les coefficients d'élasticité sont ne pas propriétés systémiques mais mesurent davantage la sensibilité des enzymes isolées aux changements de paramètres. Les coefficients d'élasticité peuvent être obtenus à partir des fonctions cinétiques de vitesse initiale illustrées sur la figure 3 par dérivation partielle. Encore une fois comme les coefficients de contrôle, les coefficients d'élasticité ne sont pas des constantes, ils dépendent de la valeur du paramètre concerné et sont donc différents pour chaque régime permanent.


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Analyse du flux métabolique des plantes : méthodes et protocoles. Humana Press Inc., 2014. p. 211-222 (Methods in Molecular Biology Vol. 1090).

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T1 - Simulation de marquage pour estimer les paramètres cinétiques pour l'analyse de contrôle de flux

N2 - Un aspect important de la modélisation cinétique est la capacité de fournir des informations prédictives sur le contrôle du réseau et les réponses dynamiques aux perturbations génétiques ou environnementales basées sur la cinétique enzymatique innée. Dans une approche descendante de l'assemblage du modèle, des paramètres cinétiques inconnus sont calculés à l'aide de données expérimentales telles que les concentrations de pool de métabolites et les modèles de marquage transitoires après fourniture d'un substrat isotopiquement marqué. Ces paramètres cinétiques peuvent ensuite être utilisés pour calculer les coefficients de contrôle de flux pour chaque réaction dans un réseau, ce qui facilite l'identification des réactions enzymatiques qui exercent le plus de contrôle sur le réseau dans son ensemble. Ce chapitre décrit une approche de modélisation pour estimer les paramètres cinétiques qui sont ensuite utilisés pour effectuer une analyse de contrôle métabolique. Un exemple est fourni pour le réseau benzénoïde de Petunia hybrida, cependant, les méthodologies peuvent être appliquées à n'importe quel petit segment du métabolisme.

AB - Un aspect important de la modélisation cinétique est la capacité de fournir des informations prédictives sur le contrôle du réseau et les réponses dynamiques aux perturbations génétiques ou environnementales basées sur la cinétique enzymatique innée. Dans une approche descendante de l'assemblage du modèle, des paramètres cinétiques inconnus sont calculés à l'aide de données expérimentales telles que les concentrations de pool de métabolites et les modèles de marquage transitoires après la fourniture d'un substrat isotopiquement marqué. Ces paramètres cinétiques peuvent ensuite être utilisés pour calculer les coefficients de contrôle de flux pour chaque réaction dans un réseau, ce qui facilite l'identification des réactions enzymatiques qui exercent le plus de contrôle sur le réseau dans son ensemble. Ce chapitre décrit une approche de modélisation pour estimer les paramètres cinétiques qui sont ensuite utilisés pour effectuer une analyse de contrôle métabolique. Un exemple est fourni pour le réseau benzénoïde de Petunia hybrida, cependant, les méthodologies peuvent être appliquées à n'importe quel petit segment du métabolisme.


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