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13.10 : Séquençage de l'ADN - Biologie


Résultats d'apprentissage

Décrire la méthode de séquençage d'ADN la plus largement utilisée

Jusqu'aux années 1990, le séquençage de l'ADN (lecture de la séquence de l'ADN) était un processus relativement long et coûteux. L'utilisation de nucléotides radiomarqués a également aggravé le problème en raison de problèmes de sécurité. Avec la technologie et les machines automatisées actuellement disponibles, le processus est bon marché, plus sûr et peut être terminé en quelques heures. Fred Sanger a développé la méthode de séquençage utilisée pour le projet de séquençage du génome humain, qui est largement utilisée aujourd'hui (Figure 1).

Visitez ce site pour regarder une vidéo expliquant la technique de lecture des séquences d'ADN qui a résulté des travaux de Sanger.

La méthode est connue sous le nom de méthode de terminaison de chaîne didésoxy. La méthode de séquençage est basée sur l'utilisation de terminateurs de chaîne, les didésoxynucléotides (ddNTP). Les didésoxynucléotides, ou ddNTPS, diffèrent des désoxynucléotides par l'absence d'un groupe 3' OH libre sur le sucre à cinq carbones. Si un ddNTP est ajouté à un brin d'ADN en croissance, la chaîne ne s'allonge plus car le groupe OH 3' libre nécessaire pour ajouter un autre nucléotide n'est pas disponible. En utilisant un rapport prédéterminé de désoxyribonucléotides aux didésoxynucléotides, il est possible de générer des fragments d'ADN de différentes tailles.

L'échantillon d'ADN à séquencer est dénaturé ou séparé en deux brins en le chauffant à haute température. L'ADN est divisé en quatre tubes dans lesquels une amorce, l'ADN polymérase et les quatre nucléotides (A, T, G et C) sont ajoutés. En plus de chacun des quatre tubes, des quantités limitées de l'un des quatre didésoxynucléotides sont respectivement ajoutées à chaque tube. Les tubes sont étiquetés A, T, G et C selon le ddNTP ajouté. À des fins de détection, chacun des quatre didésoxynucléotides porte un marqueur fluorescent différent. L'allongement de la chaîne se poursuit jusqu'à ce qu'un didésoxynucléotide fluorescent soit incorporé, après quoi aucun autre allongement n'a lieu. Une fois la réaction terminée, une électrophorèse est effectuée. Même une différence de longueur d'une seule base peut être détectée. La séquence est lue à partir d'un scanner laser. Pour ses travaux sur le séquençage de l'ADN, Sanger a reçu un prix Nobel de chimie en 1980.

Comme déjà mentionné, le gel électrophorèse (Figure 2) est une technique utilisée pour séparer des fragments d'ADN de différentes tailles. Habituellement, le gel est composé d'un produit chimique appelé agarose. La poudre d'agarose est ajoutée à un tampon et chauffée. Après refroidissement, la solution de gel est versée dans un bac de coulée. Une fois le gel solidifié, l'ADN est chargé sur le gel et un courant électrique est appliqué. L'ADN a une charge nette négative et se déplace de l'électrode négative vers l'électrode positive. Le courant électrique est appliqué pendant un temps suffisant pour permettre à l'ADN de se séparer en fonction de sa taille ; les fragments les plus petits seront les plus éloignés du puits (où l'ADN a été chargé) et les fragments de poids moléculaire les plus lourds seront les plus proches du puits. Une fois l'ADN séparé, le gel est coloré avec un colorant spécifique à l'ADN pour le visualiser.

Le séquençage du génome de Sanger a conduit à une course pour séquencer les génomes humains à une vitesse rapide et à faible coût, souvent appelée séquence de 1 000 $ en une journée. Apprenez-en plus en regardant l'animation Sequencing at Speed ​​ici.

Génome de Néandertal : comment sommes-nous liés ?

Le premier projet de séquence du génome de Néandertal a été publié par Richard E. Green et al. en 2010.[1] Les Néandertaliens sont les ancêtres les plus proches des humains d'aujourd'hui. Ils étaient connus pour avoir vécu en Europe et en Asie occidentale avant de disparaître des archives fossiles il y a environ 30 000 ans. L'équipe de Green a étudié des restes fossiles vieux de près de 40 000 ans qui ont été sélectionnés sur des sites du monde entier. Des moyens extrêmement sophistiqués de préparation des échantillons et de séquençage de l'ADN ont été employés en raison de la nature fragile des os et de la forte contamination microbienne. Dans leur étude, les scientifiques ont pu séquencer quelque quatre milliards de paires de bases. La séquence de Néandertal a été comparée à celle des humains actuels du monde entier. Après avoir comparé les séquences, les chercheurs ont découvert que le génome de Néandertal avait une similitude 2 à 3 pour cent plus grande avec les personnes vivant en dehors de l'Afrique qu'avec les personnes en Afrique. Alors que les théories actuelles ont suggéré que tous les humains actuels peuvent être attribués à une petite population ancestrale en Afrique, les données du génome de Néandertal peuvent contredire ce point de vue. Green et ses collègues ont également découvert des segments d'ADN chez les peuples d'Europe et d'Asie qui sont plus similaires aux séquences néandertaliennes qu'à d'autres séquences humaines contemporaines. Une autre observation intéressante était que les Néandertaliens sont aussi étroitement liés aux peuples de Papouasie-Nouvelle-Guinée qu'à ceux de Chine ou de France. Ceci est surprenant car les restes fossiles de Néandertal n'ont été localisés qu'en Europe et en Asie occidentale. Très probablement, des échanges génétiques ont eu lieu entre les Néandertaliens et les humains modernes lorsque les humains modernes ont émergé d'Afrique, avant la divergence des Européens, des Asiatiques de l'Est et des Papouasie-Nouvelle-Guinée.

Plusieurs gènes semblent avoir subi des changements par rapport aux Néandertaliens au cours de l'évolution de l'homme actuel. Ces gènes sont impliqués dans la structure crânienne, le métabolisme, la morphologie de la peau et le développement cognitif. L'un des gènes qui présente un intérêt particulier est RUNX2, ce qui est différent chez les humains modernes et les Néandertaliens. Ce gène est responsable de l'os frontal proéminent, de la cage thoracique en forme de cloche et des différences dentaires observées chez les Néandertaliens. On suppose qu'un changement évolutif de RUNX2 était important dans l'origine de l'homme moderne, et cela a affecté le crâne et le haut du corps.

Regardez la conférence de Svante Pääbo expliquant la recherche sur le génome de Néandertal lors de la conférence annuelle TED (Technology, Entertainment, Design) de 2011.

Un élément YouTube a été exclu de cette version du texte. Vous pouvez le consulter en ligne ici : pb.libretexts.org/bionm1/?p=494



Voir la vidéo: Séquençage de lADN (Décembre 2021).