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Comment déterminer le flux réel dans le modèle métabolique humain d'une lignée cellulaire ?


Le problème à résoudre est de déterminer quelles sont les valeurs de flux pour les différentes réactions dans le modèle métabolique humain.

D'après ce que je comprends, un bon moyen de le faire serait d'utiliser les données d'expression génique pour calculer un flux, mais je ne suis pas sûr que ce soit une bonne idée ou que ce soit même possible. Je ne suis pas très sûr de ce qui est le bon processus pour le faire.

Merci pour toute aide ou suggestions!


Je ne suis pas un expert en la matière, mais quantifier l'expression des gènes n'est pas un problème simple, même si c'est une possibilité.

Une solution que je sais être utilisée est l'utilisation de marqueurs radioactifs. Voir par exemple cette revue et en particulier la section "La navette cellule-cellule lactate", qui pourrait donner quelques indications.

Cela peut inclure des traceurs radioactifs (comme le [14C]lactate), des traceurs non radioactifs (avec [13C] ou [2H]), des "mesures d'échange net" (je ne sais pas vraiment ce que cela signifie ici, peut-être le genre de calculs d'échange qu'ils présentent ici), et des biopsies musculaires (il est alors possible de mesurer la concentration en métabolites par réaction enzymatique ou spectrophotométrie par exemple).


Résumé : Essayez l'une des extensions de FBA qui prennent en compte la régulation des gènes, mais soyez conscient des limites. Voir ci-dessous pour les références.

Longue réponse:

Il existe deux approches pour estimer les flux métaboliques internes : la (principalement) expérimentale et la (principalement) computationnelle. Je dis principalement, car même pour l'approche expérimentale, une grande quantité de calculs doit être effectuée, et pour l'approche computationnelle, des études expérimentales doivent être consultées afin de définir des paramètres de modèle réalistes.

La détermination expérimentale des flux métaboliques internes a été centrée sur l'analyse des flux métaboliques 13C (13C-MFA) réalisée par des expériences de marquage au carbone, comme mentionné ci-dessus. Le 13C-MFA est compliqué et coûteux, il y a donc un manque relatif de données expérimentales, et la plupart des expériences ne couvrent que quelques flux par rapport au nombre de réactions possibles, généralement plusieurs milliers dans les modèles métaboliques à l'échelle du génome. Dans 13C-MFA, la plupart des expériences estiment les flux dans un modèle beaucoup plus petit (par exemple le métabolisme central du carbone), en évitant ou en ignorant d'autres réactions possibles, et l'ensemble des flux estimés varie entre les expériences.

Les modèles utilisés dans les approches informatiques de l'analyse des flux sont généralement plus grands que les modèles utilisés dans les expériences 13C-MFA, et il n'est donc généralement pas possible de déterminer tous les flux à partir des données expérimentales seules. Ainsi, une approche appelée modélisation par contraintes (COBRA) est principalement utilisée. L'hypothèse de base de la plupart des méthodes d'analyse de flux actuelles, à la fois expérimentales et informatiques, est que les concentrations de métabolites sont à l'état d'équilibre. Mathématiquement, cela peut être décrit par l'équation

$Soverrightarrow v = 0$

où $S$ est un matrice stoechiométrique reliant les métabolites et toutes les réactions possibles (essentiellement une description compacte du modèle métabolique), et $overrightarrow v$ est le vecteur de flux contenant toutes les valeurs de flux. En plus de l'exigence d'état d'équilibre, des contraintes sont généralement appliquées aux taux d'absorption et d'excrétion de divers métabolites, les limitant à des valeurs biologiquement réalistes. D'autres exigences, telles que les exigences de consommation de maintenance ATP, peuvent également être appliquées.

Parce qu'il existe généralement de nombreux modèles de flux possibles qui obéissent aux contraintes ci-dessus, un principe est nécessaire pour sélectionner une solution biologiquement réaliste à partir de l'espace de solution des modèles de flux réalisables. En supposant que les cellules optimisent leurs schémas métaboliques d'une manière ou d'une autre, différentes fonctions objectifs sont utilisés pour tenter de capturer le comportement métabolique des cellules. Une fois qu'une fonction objectif est choisie, l'ensemble des solutions possibles peut être recherché pour le modèle de flux qui donne la valeur objective la plus élevée en fonction du vecteur de flux. Étant donné que l'objectif est linéaire (simplement une somme pondérée de flux), une solution optimale peut être trouvée rapidement. En général, de nombreuses solutions optimales différentes peuvent exister pour une fonction objectif donnée. La méthode d'application d'une fonction objectif à un modèle métabolique contraint à l'état d'équilibre s'appelle Flux Balance Analysis (FBA).

L'objectif le plus fondamental et le plus populaire est la maximisation de la production de biomasse. Bien qu'utile pour déterminer les taux de croissance maximaux, il est peu probable que cet objectif soit réaliste lorsqu'il est appliqué aux cellules humaines. La FBA et les méthodes associées sont généralement bien adaptées à la détermination des limites de performance pour des paramètres uniques tels que le taux de croissance ou la production d'un seul métabolite, mais ne sont pas capables de déterminer avec précision tous les flux métaboliques internes. Le fait que de nombreuses solutions optimales peuvent exister pour une seule fonction objectif est important à cet égard.

Comme le 13C-MFA et le FBA sont basés sur le même concept d'équilibrage des métabolites, ils peuvent être considérés comme des extrémités différentes du même spectre, du purement expérimental au purement informatique, avec le 13C-MFA contraint FBA (où les résultats du 13C-MFA sont utilisés pour contraindre les flux possibles dans un modèle avant d'optimiser une fonction objectif, ou de minimiser la différence entre les flux expérimentaux et la solution FBA, soumise à des contraintes supplémentaires) au milieu.

Pour une introduction à l'analyse d'équilibre de flux, voir Orth, Thiele & Palsson : « Qu'est-ce que l'analyse du bilan de flux ? » Nature Biotechnologie 28 245-48 2010.

Pour effectuer l'analyse d'équilibre de flux, plusieurs progiciels sont disponibles. L'une des plus utilisées est la COBRA Toolbox pour Matlab. Une version pour Python appelée CobraPy est également en cours de développement. Les deux sont disponibles sur http://opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html

Notez que la plupart des données d'expression génique ne montrent que des changements relatifs d'expression entre deux conditions. La plupart des méthodes sont donc basées sur la comparaison de deux conditions différentes. Plus récemment, le séquençage de l'ARN (RNAseq) peut également être utilisé pour obtenir des mesures plus directes des niveaux d'expression génique. De nombreuses extensions et variations sur FBA ont été publiées qui prennent en compte l'expression des gènes. Certains d'entre eux sont des FBA réglementaires (rFBA, Covert & Palsson : Journal de chimie biologique, 2002 277, 28058-28064), Ajustement métabolique par expression différentielle (MADE, Jensen & Papin : Bioinformatique. 15 février 2011;27(4):541-7 ) et iMAT (Schlomi et al : Bioinformatique (2010) 26 (24) : 3140-3142.). Pour une méthode plus récente, gx-FBA (expression génique-FBA), voir *Navid & Almaas, BMC Systems Biology 2012, 6:150).

Vous pouvez également lire cet article qui traite des modèles métaboliques spécifiques aux tissus de construction : Reconstruction informatique de modèles métaboliques spécifiques aux tissus : application au métabolisme hépatique humain. Mol Syst Biol. 7 septembre 2010; 6: 401. doi: 10.1038/msb.2010.56.

Le problème avec l'utilisation de FBA et des méthodes connexes pour estimer les flux internes est que la validation des résultats est difficile en raison du manque mentionné de données expérimentales. J'ai rédigé un rapport de projet sur le sujet au cours de la dernière année de ma maîtrise, qui comprend une description de base du 13C-MFA. Il peut être lu sur http://www.slideshare.net/jarlemag/rapport-31295058


Vous ne pouvez pas utiliser l'expression des gènes pour estimer les flux. Les raisons sont les suivantes. L'expression des gènes détermine les niveaux d'ARNm qui à leur tour déterminent les niveaux d'enzymes. Cependant, la relation entre l'expression des gènes et le niveau enzymatique n'est pas linéaire. Votre plus gros problème est cependant que les flux sont des propriétés dépendantes du système et ne dépendent pas d'une seule enzyme. Un flux est en principe fonction de toutes les propriétés cinétiques de chaque enzyme de la voie. La seule façon d'obtenir les flux est soit par mesure directe, soit à l'aide de modèles FBA ou cinétiques.


Inhibiteurs de la succinate déshydrogénase : in silico analyse de flux et in vivo les études métabolomiques ne montrent aucune conséquence métabolique grave pour les rats et les humains

la modélisation métabolique montre la robustesse du métabolisme des mammifères vis-à-vis de l'inhibition de la SDH.

métabolomique plasmatique in vivo réalisée avec les fongicides SDHI boscalid & fluxapyroxad.

in silico la comparaison n'a montré aucune différence pour le rat et l'humain vis-à-vis de l'inhibition de la SDH.

Exposition SDHI : pas d'accumulation de succinate/lactate chez le rat, non attendue chez l'homme.


Déduire le flux métabolique dans la recherche sur le cancer

Le métabolisme cellulaire est un système dynamique dans lequel les nutriments métaboliques sont constamment consommés et catabolisés pour générer de l'énergie (Fig. 1a). Les cellules cancéreuses proliférantes activent davantage les voies anaboliques pour produire des précurseurs métaboliques permettant de synthétiser des macromolécules, notamment de l'ADN, de l'ARN, des protéines et des lipides [1, 2]. Ceci est facilité par un réseau métabolique complexe composé de milliers de réactions biochimiques [3, 4]. La dynamique du métabolisme peut être décrite en termes de taux de réactions métaboliques, généralement appelé flux métabolique (dénotant le taux de transformation d'un substrat en métabolites produits en unités de moles par unité de temps par cellule). Un objectif majeur de la recherche métabolique sur le cancer est de comprendre comment le flux métabolique est recâblé par les tumeurs pour répondre aux demandes énergétiques et biosynthétiques [5, 6]. La compréhension des altérations spécifiques aux tumeurs du flux métabolique facilite l'identification d'une dépendance induite à des enzymes spécifiques dont l'inhibition pharmacologique cible sélectivement les cellules cancéreuses [7].

Le flux métabolique décrit la dynamique du métabolisme cellulaire. une Les nutriments métaboliques sont constamment consommés et métabolisés pour générer de l'énergie et synthétiser la biomasse pour soutenir la réplication cellulaire. b Les flux métaboliques fournissent une vue directe du phénotype métabolique cellulaire qui n'est pas facilement évident par les technologies « omiques » largement accessibles

Une complication majeure de la recherche métabolique sur le cancer est que, contrairement à la concentration d'ARNm, de protéines et de métabolites, le flux métabolique, qui reflète le phénotype métabolique cellulaire, n'est pas une quantité directement mesurable (Fig. 1b). Cependant, il peut être déduit par une combinaison de techniques expérimentales et informatiques.

L'approche la plus directe pour interroger le flux métabolique intracellulaire dans les cellules cancéreuses est le traçage isotopique [8,9,10]. Cela fonctionne en alimentant les cellules cancéreuses avec des nutriments marqués isotopiquement et en mesurant le modèle de marquage isotopique des métabolites par spectrométrie de masse ou résonance magnétique nucléaire (RMN). Nous discutons ici de l'application courante de cette approche dans les cellules cancéreuses cultivées en culture, bien qu'elle soit également utilisée pour des études in vivo [11, 12]. Le schéma de marquage isotopique des métabolites est révélateur de la contribution relative des différentes voies à leur biosynthèse. Alors qu'une inspection manuelle des distributions d'isotopes des métabolites mesurés facilite l'évaluation qualitative des activités métaboliques, l'interprétation informatique via l'analyse des flux métaboliques 13C (13C-MFA) permet en outre une inférence quantitative des flux.

Une autre approche d'inférence de flux couramment utilisée est la reconstruction et l'analyse basées sur les contraintes (COBRA), permettant l'évaluation des flux via des réseaux métaboliques à l'échelle du génome. COBRA a traditionnellement été utilisé pour modéliser le métabolisme microbien à des fins biotechnologiques et de bio-ingénierie [13,14,15]. Des reconstructions plus récentes de modèles de réseaux métaboliques humains à l'échelle du génome ont permis d'appliquer cette approche à la modélisation à grande échelle de tissus normaux et de diverses maladies humaines, dont le cancer [3, 16, 17, 18, 19]. COBRA prédit les flux à l'état d'équilibre métabolique en prenant en compte des considérations physico-chimiques, en particulier le bilan massique stoechiométrique, exigeant que les taux de production et de consommation totale de métabolites soient égaux dans des conditions d'état d'équilibre. Une caractéristique importante de COBRA est sa capacité à prédire le flux et le recâblage métabolique en incorporant divers ensembles de données « omiques », tels que la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique. Cela permet la prédiction de flux pour de grandes collections de lignées cellulaires et de tumeurs via des ensembles de données génomiques et métabolomiques fonctionnelles existantes, y compris TCGA [20], NCI60 [21], CCLE [22,23,24] et Connectivity Map [25].

Ici, nous fournissons un bref aperçu du fonctionnement de COBRA et du 13C-MFA (les lecteurs sont invités à consulter des revues complètes sur COBRA [26] et 13C-MFA [27] pour plus d'informations techniques), l'utilisation récente de ces approches dans les études de recherche sur le cancer, et les limites et les défis ouverts avec chaque approche d'inférence de flux.


Méthodes

Le cadre mathématique nécessaire pour mapper la quantité de médicament à la réponse de croissance collective du M. tuberculose bactérie exigeait que nous connections la cinétique d'inhibition enzymatique, la modélisation du réseau métabolique et les modèles de croissance de la population bactérienne. Si ces composants pouvaient être modélisés et vérifiés par des données expérimentales, nous pourrions créer un système informatique pour prédire quantitativement comment les inhibiteurs métaboliques affectent la croissance bactérienne. Ici, nous présentons le cadre qui nous a permis de générer et de reproduire les courbes dose-réponse de deux inhibiteurs métaboliques générés à partir de deux études expérimentales indépendantes.

Le cadre mathématique établit le lien entre a) la manière dont un inhibiteur particulier affecte le ou les flux d'une ou plusieurs réactions métaboliques [Modèle d'inhibition] (les réactions affectées sont appelées réactions cibles), b) la manière dont la modification du flux de métabolites ou le flux des réactions cibles diminue le taux de croissance de l'organisme [Réseau métabolique], et, enfin, c) comment le taux de croissance réduit entraîne une concentration cellulaire bactérienne inférieure efficace [Modèle de croissance de la population]. La figure 1 montre schématiquement ces trois composants et comment ils se connectent et dépendent les uns des autres. Avec les modèles spécifiés et connectés comme indiqué dans la figure 1, la procédure de calcul ne dépend que de la concentration en inhibiteur et du substrat initial et des concentrations cellulaires dans le milieu sous lequel l'organisme a été cultivé pour calculer la concentration cellulaire bactérienne ultérieure. Les détails précisant le fonctionnement interne de chaque modèle sont donnés ci-dessous.

Une vue schématique du cadre pour simuler l'effet d'un inhibiteur sur la croissance bactérienne. Compte tenu de la concentration en inhibiteur [je], le modèle d'inhibition décrit comment l'inhibiteur affecte le flux de réaction de la réaction inhibée (c'est-à-dire la réaction cible). Ces effets sont modélisés via des contraintes explicites sur le flux de réaction cible. En utilisant ces contraintes et les contraintes sur le taux d'absorption du substrat, nous avons analysé le réseau métabolique pour déduire le taux de croissance de la biomasse. ?? et taux d'absorption du substrat v C. En utilisant le modèle de croissance démographique, nous avons lié le taux de croissance de la biomasse ?? et taux d'absorption du substrat v Cà la concentration cellulaire [X]. Nous avons couplé dynamiquement le taux de croissance de la biomasse et la concentration de substrat diminuée pour développer un modèle dépendant du temps qui déduit dynamiquement la concentration cellulaire après l'introduction d'un inhibiteur. Une fois ces composants du modèle spécifiés, ainsi que le substrat initial [C0] et cellule [X0] dans le milieu de croissance, les calculs effectués dans ce cadre n'ont nécessité qu'un apport sous la forme d'une concentration spécifique d'inhibiteur [je] pour prédire la croissance cellulaire.

Modèle d'inhibition

Les modèle d'inhibition est défini par la cinétique d'inhibition enzymatique régissant les réactifs et les produits d'une réaction métabolique particulière (c'est-à-dire la réaction cible) et concerne la manière dont la concentration en inhibiteur [je] modifie ou ajoute une contrainte au flux de la réaction cible. La forme mathématique du modèle d'inhibition dépend de la cinétique enzymatique particulière associée à l'inhibiteur spécifique et de la réaction métabolique affectée par l'inhibiteur. Mathématiquement, le modèle d'inhibition rapporte une concentration d'inhibiteur [je] au rapport de flux de métabolite résultant en présence et en l'absence de l'inhibiteur. Des inhibiteurs affectant plus d'une réaction peuvent également être envisagés.

Réseau métabolique

Les réseau métabolique est utilisé pour calculer de manière cohérente le taux de croissance global de la biomasse ??, taux d'absorption du substrat v C, et les flux de toutes les réactions métaboliques. Il est couplé au modèle d'inhibition et le modèle de croissance démographique. Les modèle d'inhibition impose des contraintes sur le flux des réactions cibles dans le réseau métabolique qui affecte le taux de croissance de la biomasse totale, et le modèle de croissance démographique ajoute des contraintes au taux d'absorption du substrat du réseau par le support. L'effet des suppressions d'enzymes (mutants de suppression) sur la croissance peut être incorporé dans le modèle de réseau métabolique en supprimant les réactions particulières catalysées par les enzymes spécifiées [22, 54].

Le réseau métabolique développé par Jamshidi et Palsson [42] pour M. tuberculose, INJ 661, est capable de reproduire quantitativement les taux de croissance observés dans un certain nombre de conditions différentes. Nous avons utilisé ce réseau, avec quelques modifications, comme base de notre travail (voir Fiche complémentaire 1 : Section S1) et vérifié que les modifications n'affectaient pas le taux de croissance de M. tuberculose, comme initialement rapporté [42].

Le taux de croissance de la biomasse, les taux d'absorption du substrat et les flux de réaction ont été obtenus directement à partir du réseau métabolique en appliquant le FBA [26]. En utilisant une méthode de programmation linéaire, FBA peut maximiser le taux de croissance de la biomasse soumis au bilan de masse à l'état d'équilibre de tous les métabolites intracellulaires et aux contraintes stoechiométriques définies par les réactions. La maximisation du taux de croissance de la biomasse est basée sur l'hypothèse que les bactéries maximisent leur croissance pendant le stade exponentiel et les conditions du stade stationnaire précoce. Des études antérieures ont montré que cette hypothèse génère des résultats compatibles avec l'expérience dans de telles conditions [25, 30]. Les contraintes supplémentaires qui peuvent être modélisées dans le FBA incluent la spécification des réactions réversibles et irréversibles, ainsi que les limites imposées sur l'absorption du substrat et les taux de réaction cibles. Ici, FBA a été réalisée avec la COBRA Toolbox [55]. Nous avons également utilisé la COBRA Toolbox pour minimiser les flux de réaction tout en conservant le taux de croissance maximal calculé de la biomasse. Cette procédure nous a permis d'obtenir un ensemble unique de flux minimaux correspondant au flux le plus parcimonieux de métabolites à travers le réseau [56-58]. Ces flux ont ensuite été utilisés pour contraindre les vitesses de réaction cibles.

Modèle de croissance démographique

Compte tenu du taux de croissance de la biomasse ?? et les taux d'absorption du substrat v Cdéfini par le réseau métabolique, le modèle de croissance démographique fournit un mécanisme de calcul de la cellule [X] et substrat [C] concentrations dans le milieu spécifié. Ce modèle considère les changements dans les concentrations de substrat au fil du temps, ce qui pourrait être utilisé pour surveiller comment différentes sources de carbone sont utilisées de manière préférentielle dans le processus métabolique [30].

Mathématiquement, le modèle de croissance de la population relie le taux de croissance de la biomasse ?? à la concentration cellulaire réelle [X] des bactéries en fonction du temps t. Ce processus doit tenir compte de l'épuisement temporel du substrat limitant C dans le milieu à mesure que les cellules se développent, ce qui dépend du taux d'absorption du substrat v Cpar les cellules. Parce que plus les cellules croissent, plus elles consomment le substrat limitant, nous avons représenté ce couplage à travers les deux ODE suivantes :

où les crochets [.] indiquent la concentration de "." et [C] représente la concentration du substrat limitant C dans le milieu. Le facteur 24 convertit simplement le temps t d'heures en jours, puisque les unités de ?? et v Csont exprimés respectivement en h -1 et en mmol/(h·gDW), c'est-à-dire en mmol par heure par gramme de poids sec de M. tuberculose. L'équation 1 n'incluait pas de taux de mortalité cellulaire car nous avons simulé la croissance bactérienne au stade exponentiel et au stade stationnaire précoce, où la croissance cellulaire joue un rôle plus dominant que la mort cellulaire. Des études antérieures dans des conditions de croissance similaires, qui n'incluaient pas non plus explicitement de terme de taux de mortalité, ont obtenu des résultats de simulation cohérents avec les données expérimentales [25, 30].

Le taux de croissance de la biomasse ?? et le taux d'absorption du substrat limitant v Csont déterminés, pour un instant donné, en effectuant une FBA du réseau métabolique pour une concentration donnée d'inhibiteur [je] et une contrainte de limite supérieure sur le taux d'absorption de substrat limite. Nous avons formellement introduit une notation pour indiquer le taux de croissance ?? et le taux d'utilisation v Csorties d'un FBA d'un réseau métabolique pour un ensemble donné de conditions d'entrée [je] et comme:

Nous avons utilisé le modèle cinétique de Michaelis-Menten [25] pour estimer la limite supérieure du taux d'absorption du substrat :

V mdésigne le taux initial maximal d'absorption du substrat et K mreprésente la constante de vitesse de Michaelis-Menten. De plus, nous avons lié la lecture expérimentale, en l'occurrence la densité optique (OD) sous une lumière de longueur d'onde de 600 nm [46, 53], à la concentration cellulaire [X] par:

où K désigne une constante de proportionnalité. D'autres lectures expérimentales peuvent être prises en compte de la même manière.

Analyse de sensibilité des valeurs des paramètres

La présence d'un certain nombre de paramètres dans notre cadre mathématique a justifié une analyse de sensibilité quant à la façon dont les valeurs de paramètre attribuées ont affecté les résultats de calcul finaux. Nous avons utilisé deux métriques différentes pour déterminer la sensibilité des paramètres. Dans la première analyse, nous avons évalué la variation des résultats en fixant séparément chacune des valeurs de paramètre à des limites inférieure et supérieure raisonnables [10], dans ce cas, ± 50 % des valeurs de paramètre choisies. Dans la deuxième analyse, nous avons calculé le coefficient de sensibilité pour chacun des paramètres. Ce coefficient fournit une mesure de la dépendance entre les résultats calculés et le paramètre correspondant. Si OD représente la concentration cellulaire exprimée en densité optique sous une lumière de longueur d'onde de 600 nm et p représente le paramètre analysé pour la sensibilité, le coefficient de sensibilité est défini comme suit [59, 60] :

D'autres observables, différents de OD, peut être remplacé dans l'équation. 6. Pour calculer numériquement le coefficient de sensibilité d'un paramètre p, nous sommes partis de ∂p = +0.5p et répété le processus en réduisantp et calculer le coefficient de sensibilité jusqu'à convergence, c'est-à-dire jusqu'à des valeurs successives de ∂p a donné la même chose. Nous avons ensuite répété le processus à partir de ∂p = -0.5p jusqu'à la convergence. Dans le calcul effectué ici, les deux processus ont convergé vers la même valeur numérique.

Pour traiter les différents types de paramètres dans notre cadre, nous avons classé les paramètres modélisés en quatre groupes : groupe I inclus des paramètres issus de la littérature, groupe II inclus ceux déterminés par appariement des données expérimentales, groupe III inclus ceux supposés être dérivés d'autres paramètres, et groupe IV inclus ceux qui, par définition, étaient directement déterminés une fois les autres paramètres définis. Lors de l'analyse de sensibilité des paramètres en groupes I, II, et III, nous avons calculé des courbes dose-réponse en augmentant et en diminuant chaque paramètre de 50 % (sauf pour ceux dont les valeurs ne peuvent dépasser un) et des coefficients de sensibilité couvrant trois ordres de grandeur en concentration d'inhibiteur. Bien que les paramètres de groupe III ont été supposées être dérivées des paramètres de groupes I et II, lors de l'analyse de sensibilité pour les deux premiers groupes, nous avons maintenu les valeurs des paramètres dans groupe III fixé. De plus, parce que les paramètres de groupe IV dépendaient d'autres paramètres et que leurs valeurs changeaient au fur et à mesure que nous effectuions une analyse de sensibilité sur ces paramètres indépendants, nous n'avons pas effectué d'analyse pour ce groupe.


Spécification de l'environnement

Pour utiliser un GEM pour la prédiction des phénotypes attendus, ou pour la simulation de processus dynamiques, il faut définir la composition chimique de l'environnement (tableau 2). L'établissement de la liste des molécules disponibles dans l'environnement est simple dans des expériences de laboratoire simples, dans lesquelles des milieux définis avec une composition chimique connue sont utilisés. Dans ce contexte, des bases de données telles que Media DB [62] ou KOMODO [63] ont répertorié un grand nombre de milieux définis, facilitant grandement la modélisation métabolique. Cependant, de nombreuses expériences de laboratoire sont effectuées dans des milieux non définis contenant des ingrédients tels que «l'extrait de levure» qui ne peuvent pas être facilement répertoriés et quantifiés. Dans la nature, les microbes existent souvent dans des environnements très complexes où les apports chimiques au système ne sont pas définis, varient avec le temps et sont modifiés par d'autres microbes de l'environnement. De plus, il ne suffit pas de connaître la liste des composés présents dans le milieu de culture, mais il faut aussi savoir à quelles vitesses les composés peuvent être consommés par l'organisme pour bien cerner les réactions de captation du modèle métabolique. En principe, la composition de l'environnement peut être déterminée par des techniques expérimentales telles que l'exo-métabolomique, où les mesures des métabolites dans l'environnement extracellulaire sont utilisées pour déduire les taux d'absorption et de sécrétion cellulaires [64,65,66,67,68]. Cette approche peut fournir des informations précieuses pour réduire l'incertitude dans la spécification de l'environnement. Cependant, ces données sont accompagnées de leur propre incertitude qui doit être soigneusement traitée [69]. Tous ces facteurs conduisent à un large éventail d'incertitudes survenant dans la spécification de l'environnement pour l'analyse du réseau métabolique [70].

Les GEM offrent une opportunité de traiter l'incertitude associée aux environnements complexes. Les algorithmes d'analyse GEM, tels que FBA, sont efficaces en termes de calcul et peuvent donc être exécutés dans un large ensemble d'environnements pour quantifier la sensibilité des flux simulés à la composition en éléments nutritifs. Plusieurs études ont quantifié cette sensibilité en identifiant les aspects des prédictions GEM qui sont soit fortement affectés par, soit robustes à la variation de la composition environnementale [71,72,73,74,75,76,77]. La description de cette sensibilité, ou robustesse, fournit une image plus claire de la façon dont l'incertitude dans la spécification de l'environnement peut, ou non, se propager à des prédictions GEM spécifiques. Très tôt, une analyse du plan de phase du phénotype a été développée pour montrer l'impact sur le taux de croissance optimal de la variation des flux de deux ressources limitantes [71, 72]. Au-delà des paires de ressources, de grands ensembles de nutriments peuvent être échantillonnés au hasard pour évaluer la variabilité de tous les flux intracellulaires. Par exemple, Almaas et al. montré, à l'aide d'un Escherichia coli GEM, que la distribution globale des flux métaboliques est robuste à la composition environnementale, cependant, les flux spécifiques varient, la plupart des variations discrètes se produisant dans une « épine dorsale à haut flux » de réactions [73]. Des travaux ultérieurs ont mis en évidence l'importance évolutive d'un noyau actif de réactions qui transportent des flux dans tous les environnements [74]. Reed et Palsson ont en outre démontré que les réactions avec des flux corrélés à travers les environnements sont indicatives de la structure de régulation transcriptionnelle [75]. Ces études soulignent la nature non triviale de la sensibilité des prédictions GEM aux spécifications de l'environnement. Au-delà du contexte des organismes individuels, l'analyse GEM a été utilisée pour démontrer que la variation de l'environnement peut modifier la nature des interactions métaboliques entre les organismes microbiens [78] et que certaines variables environnementales, telles que la présence d'oxygène, peuvent avoir un impact significatif sur les types d'interaction qui surviennent [79]. Des environnements variables peuvent avoir un impact sur le métabolisme cellulaire depuis les flux de réaction individuels jusqu'au niveau des interactions microbiennes. Ainsi, dans les applications où l'environnement est incertain, des approches d'ensemble ou probabilistes sont nécessaires pour capturer pleinement les phénotypes potentiels.

Une approche plus récente, inspirée du concept de physique statistique de percolation de réseau, utilise un échantillonnage aléatoire de compositions nutritives pour quantifier quels métabolites peuvent être produits de manière cohérente par un réseau métabolique donné dans de nombreux environnements [80]. Cette approche a introduit un cadre probabiliste pour représenter les métabolites d'entrée d'un réseau métabolique, ce qui pourrait faciliter davantage l'échantillonnage aléatoire d'ensembles environnementaux dans les méthodes futures. Alors que la mise en œuvre actuelle de ce cadre échantillonne tous les métabolites environnementaux avec une probabilité égale, on pourrait envisager des approches futures qui représentent plus précisément les incertitudes environnementales en utilisant des distributions biaisées qui intègrent toutes les connaissances disponibles. Cette approche comblerait l'écart existant entre l'hypothèse d'un seul environnement connu et l'échantillonnage aléatoire des environnements de manière uniforme. De plus, l'échantillonnage de l'environnement pourrait être utilisé pour faire varier le flux (en FBA) ou les concentrations (en FBA dynamique) de différents composants environnementaux, en plus de leur présence et de leur absence, afin d'évaluer l'impact de ces quantités sur les propriétés du réseau métabolique.

La spécification de l'environnement pour l'analyse GEM pourrait être encore améliorée en utilisant des méthodes d'« écologie inverse » qui visent à déduire l'environnement natif de la structure du réseau métabolique soit par une optimisation basée sur les contraintes [81,82,83] soit en définissant des métabolites « graines ». qui sont nécessaires comme intrants pour un réseau métabolique et sont donc plus susceptibles de se trouver dans l'environnement naturel de cet organisme [84, 85]. Étant donné que ces méthodes utilisent la structure du réseau métabolique pour informer la spécification de l'environnement, elles doivent être appliquées avec précaution car l'incertitude dans le réseau peut se propager dans la spécification de l'environnement.


Discussion

Métabolisme dans AGE1.HN

Le métabolisme et les changements métaboliques de la nouvelle lignée cellulaire humaine AGE1.HN ont été analysés quantitativement dans cette étude à l'aide d'une analyse de flux métabolique résolue dans le temps et d'une analyse de flux métabolique stationnaire dans différentes phases au cours de la culture par lots. Nos résultats indiquent que l'absorption de pyruvate pendant la phase 1 en combinaison avec des niveaux élevés d'autres substrats a entraîné un phénotype métabolique inefficace caractérisé par un métabolisme de débordement conduisant à la formation de déchets. Dans la phase 2, le métabolisme passait à un état le plus efficace caractérisé par de faibles taux d'absorption de substrat et aucune formation de lactate. Les données indiquent qu'une diminution des niveaux de substrat survenant au cours de la culture a entraîné un ralentissement de la glycolyse au cours de la phase 1. Des expériences supplémentaires utilisant différentes concentrations de pyruvate dans le milieu appuient la conclusion qu'il existe un lien étroit entre le pyruvate dans le milieu et la production de lactate dans le milieu. AGE1.HN (les données seront présentées ailleurs). Une autre possibilité serait que les cellules ne sécrètent du lactate que jusqu'à une certaine concentration et arrêtent alors la production. Cependant, dans d'autres expériences qui ont été réalisées en utilisant des concentrations de départ de lactate élevées (environ 8 mM), il a été observé que les cellules produisaient presque la même quantité de lactate que dans les expériences où la concentration de départ de lactate était de 0. Cela indique que l'épuisement du pyruvate semble être un facteur important pour l'arrêt de la production de lactate. Ce phénotype particulier n'a jusqu'à présent pas été observé dans d'autres cellules de mammifères [22, 23, 26, 41].

Au cours de la croissance exponentielle des cellules de mammifères à des niveaux de substrat non limitatifs, une utilisation inefficace du substrat a été signalée pour plusieurs autres lignées cellulaires de mammifères [22, 23, 28, 42]. Habituellement, seule une petite quantité de pyruvate intracellulaire entre dans le cycle du TCA dans ces conditions, ce qui est considéré comme très défavorable. Increasing flux through pyruvate dehydrogenase represents an optimization target for the cultivation of many mammalian cells, but the mechanisms and molecular reasons are still poorly understood [43, 44]. In a recent study on HEK-293, cells pyruvate dehydrogenase activity was reported to be around 22% of glycolytic activity [42]. Very low or even no activity of the pyruvate dehydrogenase complex was reported in other studies on different mammalian cells [23, 45]. In AGE1.HN cells, this was observed only during the first phase. During phases 2 and 3, pyruvate dehydrogenase activity was high. In MDCK cells it was found that an addition of pyruvate in a glutamine depleted medium resulted even in an increase in the flux from pyruvate into the TCA cycle [23]. In AGE1.HN, it seems that available pyruvate has an opposite effect triggering the conversion of pyruvate to lactate. High uptake rates of glucose and pyruvate as observed in phase 1 might lead to an increase of the intracellular pyruvate pool triggering overflow metabolism into lactate/alanine eventually resulting in an increased secretion of these waste metabolites. This might be changed by increasing reactions connecting TCA cycle and glycolysis, e.g., by stimulating pyruvate dehydrogenase and pyruvate carboxylase fluxes [46, 47]. However, the success of this strategy can not be predicted a priori. Increase of fluxes into the TCA cycle must be accompanied by an increase in oxidative phosphorylation activity which might not always be possible. Another strategy that is working in the opposite direction would be decreasing the substrate uptake rates, e.g., by knock down of transporters [48] or decreasing the lactate production, e.g., by knock down of lactate dehydrogenase [40].

Comparison of selected metabolic fluxes in AGE1.HN with those in other cells

Selected metabolic fluxes in AGE1.HN that were calculated by the stationary method for different phases are compared to fluxes published for other mammalian cells (Table 2). Glucose uptake and lactate production rates were generally lower in AGE1.HN than in other cells. Pyruvate represents an extracellular metabolite that was often neglected in other studies [26, 28]. However, as shown in this study and in MDCK cells [23, 49] or CHO cells [50], it is a very interesting metabolite that can induce huge changes in the metabolism. In AGE1.HN cells pyruvate uptake rate was by far lower than in MDCK cells that were grown in high pyruvate medium (Table 2, M2). However, the ratio of pyruvate uptake per glucose uptake was similar. The second phase in AGE1.HN showed a very efficient metabolism concerning substrate usage as already discussed before. The cells were proliferating without lactate production. Pyruvate dehydrogenase (PDH) activity was high. In all other cell lines, high lactate production was observed during the phases that were analyzed by MFA except for CHO cells in presence of galactose after glucose depletion. In order to reach higher cell densities in cultivations of AGE.HN, the second phase could be prolonged by feeding of glutamine. PDH activity in AGE1.HN was low in phase 1 and high in phases 2 and 3. A similar situation was observed in CHO cells [26] which exhibited low PDH activity and overflow metabolism during growth on glucose. After glucose depletion, these cells were consuming lactate in the presence of galactose having high PDH activity. No PDH activity was reported for MDCK cells in glutamine containing medium. In medium without glutamine and high pyruvate concentration low PDH activity was found in these cells. The absolute flux through PDH was highest in continuously cultured hybridoma cells [28], but the metabolism was by far not as efficient as in phase 2 of AGE1.HN since there was high glucose consumption and waste product formation. Absolute glutamate dehydrogenase (GDH) activity of AGE1.HN during phases 1 and 2 was lower than in other cell lines, but the relative activity compared to the glucose uptake rate was quite similar in MDCK and CHO cultures. Upper and lower TCA cycle activity in phases 2 and 3 was similar to the activity in CHO cells with glucose medium (S1 in Table 2) and in MDCK cells (M2 in Table 2) cultured without glutamine. For hybridoma cells, higher TCA cycle activity was reported.

The main differences between the metabolic phases of AGE1.HN are summarized in Fig. 7. The results indicate further targets for improving the metabolic phenotype of these cells to reach higher cell densities as well as to obtain a more efficient utilization of the nutrients. The high overflow metabolism in the beginning of the cultivation with channeling of pyruvate to lactate could be decreased. This could be accomplished by genetic engineering, e.g., deletion of lactate dehydrogenase [51] or introduction of pyruvate carboxylase [46], further medium optimization, e.g., reduced concentrations of pyruvate, or application of new feeding strategies [50]. The observed metabolism in phase 2 indicates the potential of this cell line to grow very efficiently having minimum formation of waste products and minimum energy spilling [52]. Therefore, it seems promising to change environmental conditions, i.e., media, substrate feeding as well as enzyme expression such as to approach the efficient metabolic state of phase 2 during a process. Studies on enzyme expression and detailed labelling experiments in combination with 13 C metabolic flux analysis would provide additional hints for the best way to further improve the cell line.

Summary of metabolic shifts during batch cultivation of AGE1.HN

Time resolved versus stationary flux analysis

The applied dynamic method is well suited to analyze and monitor metabolic shifts during the cultivation. Cell growth, cell size, extracellular as well as intracellular fluxes of mammalian cells in a cell culture process are highly dynamic which is caused by environmental changes. Therefore, the presented method that is considering the dynamics of all included metabolites and biomass is best suited to understand and finally model the process. Stationary metabolic flux analysis that was applied extensively in the past [23, 53] is only suited to describe the mean metabolism during a certain phase which is a significant disadvantage since changes during the phase considered are neglected [54]. However, if the pseudo steady state assumption during a phase is justified, it can give a useful overview of its average metabolism [55]. The information obtained by flux balance analysis can be validated [56] or further enriched by specific labelling information [57] to resolve reversible, cyclic or parallel fluxes as for example pentose phosphate pathway split [58, 59].


Renseignements à l'appui

S1 Figue

A) The electron micrographs of SARS-CoV-2 (Credit: NIAID-RML) B) Number of spike proteins calculated from intensity measurements of the micrograph along the circumference of the virus.

S2 Fig

The processed final model is used for differential flux analysis.

S3 Fig

The uptake rates were varied and a point optimization program was used to calculate the specific growth rate. The fitness change is reported as the ratio of specific growth rate under perturbation to the specific growth rate under normal uptake rate. All the uptake rates were negative.

S4 Fig

The coefficients of biomass precursors were varied by 널% taken one at a time and the specific growth rate was calculated by FBA.

S1 Dataset

The sheets in the dataset comprises of stepwise calculation of SARS-CoV-2 amino acid composition, nucleotide composition, carbohydrate and lipid composition. The last sheet comprises of the final viral biomass equation.

S2 Dataset

The description of each dataset within S2 Dataset are given in the first sheet.

S1 Text


1. INTRODUCTION

From its inception, classical biology has relied on reductionist principles. However, the actual nature of the cell, in which all components interact, demanded switching the previous paradigm to a holistic molecular approach, extending the scope of the analysis. These are the foundations that motivated the development of systems biology in the second half of the twentieth century. In particular, systems biology aims at studying the biological processes in terms of the cellular components and their interactions from a holistic molecular perspective ( Kitano, 2002 ).

Some of these components interact in the cellular metabolism, which comprises those biochemical reactions consuming and producing the smallest compounds of the cell, typically named metabolites. These reactions are close to be in thermodynamic equilibrium, requiring the presence of catalytic agents so as to achieve the appropriate rate of activity to sustain life. In most metabolic reactions, a set of proteins named enzymes act as catalysts. The conversion rate of the metabolic reactions is termed metabolic fluxes.

Metabolic reactions are organized into distinct functional modules, forming the so-called metabolic pathways. Some of these pathways have been experimentally reported and manually included in different databases ( Kanehisa et al. , 2012 Keseler et al. , 2011 ), as well as in biochemistry books ( Nelson and Cox, 2000 ), e.g. glycolysis, TCA cycle. However, metabolic pathways are not independent entities for example, the same enzyme or metabolite may appear in different pathways. For this reason, a most general analysis of metabolism requires the simultaneous consideration of different metabolic pathways. In the most extreme scenario, when all the known metabolic pathways are considered, the resulting set of enzymes and metabolites is referred to as genome-scale metabolic networks (GSMNs). The outbreak of different high-throughput experimental techniques has allowed us to increase the accuracy and size of GSMNs, in terms of metabolites, reactions and gene regulation. Currently, GSMNs for several organisms are publicly available through different online repositories ( Schellenberger et al. , 2010 ).

The inherent complexity of GSMNs does not make it possible to perform a manual analysis per se. Different computational strategies have been developed ( Planes and Beasley, 2008 ). Among them, a number of theoretical frameworks have been proposed to extend the concept of metabolic pathways from a network-oriented perspective ( de Figueiredo et al. , 2009 Pey et al. , 2011 , 2013 ). One of the most important pathway concepts is that of Elementary Flux Mode (EFM) ( Schuster et al. , 2000 ). EFMs are a minimum set of enzymes necessary to accomplish mass-balance and thermodynamic (irreversibility) conditions ( Schuster et al. , 2000 ). Although the mass-balance and thermodynamic constraints are directly imposed by means of two linear constraints, the condition that guarantees that only a minimum number of reactions is active, referred to as the non-decomposability condition (NDC), is more difficult and demands further mathematical considerations.

Efficient algebraic frameworks can be found in the literature for calculating the whole set of EFMs of a given metabolic network. These methods are based on an iterative process that has to be completed so as to guarantee that the obtained solutions are EFMs. However, the number of EFMs increases exponentially with the number of reactions constituting the network ( Acuña et al. , 2010 ). Consequently, applying these methodologies to GSMNs goes beyond their scope. Because it is not possible to calculate all the EFMs in GSMNs, different mathematical frameworks were later developed to provide a particular subset of them ( de Figueiredo et al. , 2009 Machado et al. , 2012 Rezola et al. , 2013 ), most of them based on Mixed Integer Linear Programming (MILP).

These optimization methods typically enumerate EFMs in an increasing number of reactions and have been proved effective for a number of applications ( Rezola et al. , 2013 , 2014 ). However, they allow us to add only one biological constraint in the search procedure, e.g. computing the 100 shortest EFMs producing L-lysine, as stated by de Figueiredo et al. (2009). This limitation is due to NDC. In other words, currently in the literature, there is no general methodology for taking into account more than one biological constraint in the EFM computation without violating NDC.

In this work, we present a novel approach based on MILP that is able to calculate a subset of EFMs fulfilling additional constraints. The framework is illustrated with a toy example and validated with two networks ( Rezola et al. , 2011 Schuster et al. , 2000 ), where all EFMs can be obtained. Subsequently, the scalability of our approach is confirmed by calculating a subset of EFMs in the genome-scale metabolic network of Saccharomyces cerevisiae ( Heavner et al. , 2012 ). Here, we investigated EFMs simultaneously consuming glucose and producing ethanol, guaranteeing that a minimum yield is achieved. We also validated the performance of this new approach when more than two constraints are imposed, particularly by calculating 100 EFMs activating a random set of five reactions.


The study of metabolic pathways

There are two main reasons for studying a metabolic pathway: (1) to describe, in quantitative terms, the chemical changes catalyzed by the component enzymes of the route and (2) to describe the various intracellular controls that govern the rate at which the pathway functions.

Studies with whole organisms or organs can provide information that one substance is converted to another and that this process is localized in a certain tissue for example, experiments can show that urea, the chief nitrogen-containing end product of protein metabolism in mammals, is formed exclusively in the liver. They cannot reveal, however, the details of the enzymatic steps involved. Clues to the identity of the products involved, and to the possible chemical changes effected by component enzymes, can be provided in any of four ways involving studies with either whole organisms or tissues.

First, under stress or the imbalances associated with diseases, certain metabolites may accumulate to a greater extent than normal. Thus, during the stress of intense exercise, lactic acid appears in the blood, while glycogen, the form in which carbohydrate is stored in muscle, disappears. Such observations do not, however, prove that lactic acid is a normal intermediate of glycogen catabolism rather, they show only that compounds capable of yielding lactic acid are likely to be normal intermediates. Indeed, in the example, lactic acid is formed in response to abnormal circumstances and is not directly formed in the pathways of carbohydrate catabolism.

Second, the administration of metabolic poisons may lead to the accumulation of specific metabolites. If fluoroacetic acid or fluorocitric acid is ingested by animals, for example, citric acid accumulates in the liver. This correctly suggests that fluorocitric acid administered as such, or formed from fluoroacetic acid via the tricarboxylic acid (TCA) cycle, inhibits an enzyme of citrate oxidation.

Third, the fate of any nutrient—indeed, often the fate of a particular chemical group or atom in a nutrient—can be followed with relative ease by administering the nutrient labeled with an isotope. Isotopes are forms of an element that are chemically indistinguishable from each other but differ in physical properties.

The use of a nonradioactive isotope of nitrogen in the 1930s first revealed the dynamic state of body constituents. It had previously been believed that the proteins of tissues are stable once formed, disappearing only with the death of the cell. By feeding amino acids labeled with isotopic nitrogen to rats, it was discovered that the isotope was incorporated into many of the amino acids found in proteins of the liver and the gut, even though the total protein content of these tissues did not change. This suggested that the proteins of these tissues exist in a dynamic steady state, in which relatively high rates of synthesis are counterbalanced by equal rates of degradation. Thus, although the average liver cell has a life-span of several months, half of its proteins are synthesized and degraded every five to six days. On the other hand, the proteins of the muscle or the brain, tissues that (unlike the gut or liver) need not adjust to changes in the chemical composition of their milieu, do not turn over as rapidly. The high rates of turnover observed in liver and gut tissues indicate that the coarse controls, exerted through the onset and cessation of synthesis of pacemaker enzymes, do occur in animal cells.

Finally, genetically altered organisms ( mutants) fail to synthesize certain enzymes in an active form. Such defects, if not lethal, result in the accumulation and excretion of the substrate of the defective enzyme in normal organisms, the substrate would not accumulate, because it would be acted upon by the enzyme. The significance of this observation was first realized in the early 20th century when the phrase “inborn errors of metabolism” was used to describe hereditary conditions in which a variety of amino acids and other metabolites are excreted in the urine. In microorganisms, in which it is relatively easy to cause genetic mutations and to select specific mutants, this technique has been very useful. In addition to their utility in the unraveling of metabolic pathways, the use of mutants in the early 1940s led to the postulation of the one gene-one enzyme hypothesis by the Nobel Prize winners George W. Beadle and Edward L. Tatum their discoveries opened the field of biochemical genetics and first revealed the nature of the fine controls of metabolism.

Because detailed information about the mechanisms of component enzymatic steps in any metabolic pathway cannot be obtained from studies with whole organisms or tissues, various techniques have been developed for studying these processes—e.g., sliced tissues, and homogenates and cell-free extracts, which are produced by physical disruption of the cells and the removal of cell walls and other debris. The sliced-tissue technique was successfully used by the Nobel Prize winner Sir Hans Krebs in his pioneer studies in the early 1930s on the mechanism of urea formation in the liver. Measurements were made of the stimulating effects of small quantities of amino acids on both the rate of oxygen uptake and the amount of oxygen taken up the amino acids were added to liver slices bathed in a nutrient medium. Such measurements revealed the cyclic nature of the process specific amino acids acted as catalysts, stimulating respiration to an extent greater than expected from the quantities added. This was because the added material had been re-formed in the course of the cycle (voir ci-dessous Disposal of nitrogen).

Homogenates of tissue are useful in studying metabolic processes because permeability barriers that may prevent ready access of external materials to cell components are destroyed. The tissue is usually minced, blended, or otherwise disrupted in a medium that is suitably buffered to maintain the normal acid–base balance of the tissue, and contains the ions required for many life processes, chiefly sodium, potassium, and magnesium. The tissue is either used directly—as was done by Krebs in elucidating, in 1937, the TCA cycle from studies of the respiration of minced pigeon breast muscle—or fractionated (i.e., broken down) further. If the latter procedure is followed, homogenization is often carried out in a medium containing a high concentration of the sugar sucrose, which provides a milieu favourable for maintaining the integrity of cellular components. The components are recovered by careful spinning in a centrifuge, at a series of increasing speeds. It is thus possible to obtain fractions containing predominantly one type of organelle: nuclei (and some unbroken cells) mitochondria, lysosomes, and microbodies microsomes (i.e., ribosomes and endoplasmic reticulum fragments) and—after prolonged centrifugation at forces in excess of 100,000 times gravity—a clear liquid that represents the soluble fraction of the cytoplasm. The fractions thus obtained can be further purified and tested for their capacity to carry out a given metabolic step or steps. This procedure was used to show that isolated mitochondria catalyze the oxidation reactions of the TCA cycle and that these organelles also contain the enzymes of fatty acid oxidation. Similarly, isolated ribosomes are used to study the pathway and mechanism of protein synthesis.

The final step in elucidating a reaction in a metabolic pathway includes isolation of the enzyme involved. The rate of the reaction and the factors that control the activity of the enzyme are then measured.

It should be emphasized that biochemists realize that studies on isolated and highly purified systems, such as those briefly described above, can do no more than approximate biological reality. The identification of the fine and coarse controls of a metabolic pathway, and (when appropriate) other influences on that pathway, must ultimately involve the study of the pathway in the whole cell or organism. Although some techniques have proved adequate for relating findings in the test tube to the situation in living organisms, study of the more complex metabolic processes, such as those involved in differentiation and development, may require the elaboration of new experimental approaches.


Informations sur l'auteur

Affiliations

Bio-X Institutes, Key laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200030, People’s Republic of China

Fangzhou Shen, Hang Zhang & Zhuo Wang

Key Laboratory of Synthetic Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200032, People’s Republic of China

School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, People’s Republic of China

Luoxi Shi, Hang Zhang, Yangmin Chen & Zhuo Wang

Division of Biostatistics, School of Public Health, University of Minnesota, Minneapolis, 55455, USA

The Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100093, People’s Republic of China