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Quelle est la différence entre la HPLC et la FPLC et pourquoi la FPLC est-elle préférable pour la purification des protéines ?


J'ai déjà utilisé la HPLC (chromatographie liquide à haute performance) (une fois, donc je suis à peine qualifié pour savoir ce que cela signifie), j'ai donc été surpris lorsque ma collègue de laboratoire m'a dit qu'elle utiliserait une autre technique pour isoler une protéine.

Quelles sont exactement les différences entre les instruments HPLC et FPLC (chromatographie liquide rapide sur protéines), et pourquoi la FPLC serait-elle une meilleure technique que la HPLC à utiliser avec les protéines ? Dans quelles situations la HPLC est-elle préférable ?


La seule différence entre FPLC et HPLC est la quantité de pression que les pompes appliquent à la colonne. Les colonnes FPLC ont une pression maximale d'environ 3 à 4 MPa, tandis que les colonnes HPLC peuvent supporter ou nécessiter des pressions beaucoup plus élevées. En règle générale, les colonnes HPLC ne fonctionneront pas avec les anciens équipements FPLC ; Les colonnes FPLC peuvent fonctionner sur des HPLC tant que la pression peut être régulée.

Les fabricants commercialisent des équipements distincts pour gérer ces différentes classes de colonnes, mais la tendance semble se diriger vers des machines capables de gérer les deux types de colonnes sans problème. Il y a quelques années, un représentant de GE m'a dit qu'ils avaient amélioré les pompes des AKTA au point que "ce sont techniquement des HPLC maintenant". Le terme "FPLC" est probablement en train de disparaître.


Chromatographie liquide rapide des protéines

3.2.3.7 Chromatographie liquide rapide des protéines

La chromatographie liquide rapide sur protéines (FPLC, anciennement appelée « chromatographie liquide à performance rapide ») est une forme de chromatographie moyenne pression développée à l'origine pour purifier les protéines avec une résolution et une reproductibilité élevées. Sa particularité est que la phase stationnaire est composée de billes de petit diamètre (généralement de l'agarose réticulé) qui sont conditionnées dans des colonnes en verre ou en plastique et ont une capacité de charge élevée. Les résines pour FPLC sont disponibles dans une large gamme de tailles de particules et de surfaces de ligand, qui sont sélectionnées sur la base de leur application.

Le système FPLC permet d'utiliser une large gamme de tampons aqueux (la phase mobile) et différentes phases stationnaires pour réaliser les principaux modes de chromatographie (échange d'ions, filtration sur gel, affinité, chromatofocalisation, interaction hydrophobe, phase inverse). Cependant, la chromatographie par échange d'anions et la chromatographie par filtration sur gel sont les modes les plus couramment utilisés.

En général, la phase mobile est une solution tampon aqueuse, dont le débit à travers la phase stationnaire est contrôlé par une pompe (normalement maintenue constante), tandis que la composition du tampon peut varier en mélangeant deux ou plusieurs solutions contenues dans des réservoirs externes. Dans les stratégies FPLC les plus courantes, par exemple l'échange d'ions, la résine est sélectionnée de manière à ce que la protéine donnée puisse être liée à la résine par interaction de charge dans un tampon A (tampon courant), et par la suite, elle peut être dissociée et reprise à la solution dans un tampon B (tampon d'élution). Contrairement à la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la pression tampon utilisée est faible, généralement 5 bars, mais le débit est élevé (par exemple, 1 à 5 ml.min -1 ). La chromatographie FPLC peut être étendue, permettant l'analyse d'échantillons contenant des milligrammes de protéines dans des colonnes de 5 mL à la production préparatoire de kilogrammes de protéines purifiées en utilisant des colonnes de plusieurs litres de volume.


Lequel est bon pour moi?

Il existe de nombreux facteurs différents à prendre en compte avant d'acheter un système FPLC tel qu'un ӒKTA. Le premier est à quel point votre laboratoire dépend des services de purification des protéines. Pour les laboratoires qui ont rarement besoin de produire leurs protéines et qui ont exécuté des colonnes manuellement, un système bas de gamme comme le ӒKTA start répondra probablement à leurs besoins grâce à son automatisation de nombreux types de chromatographie. Pour les laboratoires qui purifient régulièrement les protéines et souhaitent automatiser des techniques de chromatographie plus avancées telles que l'exclusion stérique, le ӒKTA go serait un bon système pour commencer. Si des protocoles de purification plus avancés avec des lectures complexes sont courants dans votre laboratoire, un système hautement personnalisable comme le ӒKTA pure satisfera à toutes ces conditions tout en offrant des opportunités de mises à niveau futures. Pour les laboratoires qui purifient les protéines 24 heures sur 24 et ont besoin d'augmenter leur flux de travail tout en augmentant le débit, un système haut de gamme comme le ӒKTA Avant serait le plus idéal. Bien que de nombreux détails complexes de tous les systèmes ӒKTA aient été omis de cet article par souci de concision, les descriptions générales des capacités offertes par ces systèmes devraient être suffisantes pour inciter les acheteurs potentiels à chercher dans la bonne direction.


Considérations générales

Cette section fournit des considérations générales pour la chromatographie d'interaction hydrophobe, y compris des facteurs tels que le ligand, la matrice, la concentration en sel, le pH et la température.

Ligand
Le comportement d'adsorption d'une protéine est déterminé par le type de ligand immobilisé. En général, les ligands alkyle à chaîne droite présentent un caractère hydrophobe tandis que les ligands aryle présentent un comportement en mode mixte où des interactions à la fois aromatiques et hydrophobes sont possibles (Hofstee et Otillio, 1978). Le choix du type de ligand est déterminé empiriquement.

Degré de substitution
La capacité de liaison aux protéines augmente avec un degré accru de substitution du ligand immobilisé. Avec un niveau élevé de substitution de ligand, la capacité de liaison reste constante cependant, l'affinité de l'interaction augmente (Jennissen et Heilmeyer, 1975). Les protéines liées dans ces conditions sont difficiles à éluer en raison de l'attachement multipoint (Jennissen, 1978).

Matrice
Les supports les plus utilisés sont les glucides hydrophiles : agarose réticulé et matériaux copolymères synthétiques. La sélectivité entre différents supports ne sera pas identique bien que les ligands puissent être les mêmes. Modifiez les conditions d'adsorption et d'élution pour obtenir des résultats similaires lors du passage d'un support à un autre.

Concentration de sel
L'ajout de sels structurés au tampon d'équilibrage et à l'échantillon favorise les interactions ligand-protéine dans HIC (Porath et al., 1973). À mesure que la concentration en sel augmente, la quantité de protéines liées augmente, tout comme le risque de précipitation des protéines à la force ionique la plus élevée.

La figure ci-dessous représente la série Hofmeister sur l'effet de certains anions et cations sur la précipitation des protéines. Bien que les sulfates de sodium, de potassium ou d'ammonium produisent des effets de précipitation relativement plus élevés, ces sels favorisent efficacement les interactions ligand-protéine dans HIC. La plupart des protéines liées sont éluées par lavage avec de l'eau ou un tampon dilué à un pH proche de la neutralité.

Effet des anions et des cations sur la précipitation des protéines.

pH
Les phases mobiles HIC sont généralement dans la plage de pH neutre de 5&ndash7 et tamponnées avec du phosphate de sodium ou de potassium. En général, la force de l'interaction entre les protéines et le milieu diminue avec l'augmentation du pH en raison de l'augmentation de la charge de la protéine due au titrage des groupes acides. Cet effet peut varier d'une protéine à l'autre. Ainsi, le pH peut avoir un impact sur le niveau de liaison aux protéines et la sélectivité du milieu. Cependant, les changements de pH n'ont pas d'effet significatif sur des plages modérées. Bien qu'il soit utile de déterminer le pH optimal, les gradients de pH ne sont généralement pas utilisés comme méthode d'élution.

Température
L'affinité des interactions hydrophobes augmente avec la température. La température a également un impact sur la structure des protéines, la solubilité et l'interaction avec la matrice HIC. Étant donné que les effets de la température peuvent être difficiles à prévoir, il n'est généralement pas utilisé pour moduler la séparation à l'aide de HIC. Sans surprise, les expériences menées à température ambiante peuvent ne pas être reproduites dans une chambre froide.


Types de HPLC

Les deux variantes les plus courantes sont la HPLC en phase normale et en phase inverse.


HPLC en phase normale
La colonne est remplie de minuscules particules de silice et d'un solvant non polaire, par exemple de l'hexane. Une colonne typique a un diamètre interne de 4,6 mm ou moins et une longueur de 150 à 250 mm. Les composés non polaires du mélange passeront plus rapidement à travers la colonne, car les composés polaires colleront plus longtemps à la silice polaire que les composés non polaires.

HPLC en phase inversée
La taille de la colonne est la même. La colonne est remplie de particules de silice qui sont modifiées pour les rendre non polaires. Cela se fait en attachant de longues chaînes d'hydrocarbures (8 à 18 atomes de carbone) à sa surface. Un solvant polaire est utilisé, par exemple, un mélange d'eau et d'un alcool tel que le méthanol. Les composés polaires du mélange traverseront plus rapidement la colonne car une forte attraction se produit entre le solvant polaire et les molécules polaires du mélange.

Les molécules non polaires sont ralenties sur leur chemin à travers la colonne. Ils forment des degrés variables d'attraction avec les groupes d'hydrocarbures principalement par les forces de dispersion de van der Waals et les interactions hydrophobes. Ils sont également moins solubles dans les composants de la phase mobile aqueuse facilitant leurs interactions avec les groupes hydrocarbonés.


Le rôle de la HPLC dans l'analyse des vecteurs de thérapie génique AAV

Les produits de thérapie génique exploitent la biologie des virus, transférant les séquences génétiques d'une thérapeutique dans des cellules ciblées. 1 Les vecteurs viraux sont des outils couramment utilisés en génétique car ils permettent le mouvement du matériel génétique à l'intérieur des cellules dans un processus appelé transduction. Les cellules infectées sont décrites comme étant transduites. 1 Une fois qu'une séquence génétique est transduite, la thérapeutique est exprimée par la cellule du gène. Dans ce cadre, il existe deux stratégies clés : ex vivo et in vivo. Ex vivo implique l'élimination et la transduction des cellules défectueuses du patient, avant d'être réintroduites, alors que in vivo voit ce processus se dérouler sans élimination des cellules. 1

La première recherche clinique approuvée en thérapie génique a impliqué le ex vivo méthodologie. Elle s'est déroulée aux USA en 1990, au National Institute of Health. 2 Le traitement concernait une fillette de quatre ans qui souffrait d'une maladie génétique, le déficit en adénosine désaminase (ADA), qui l'a laissée avec une grave déficience du système immunitaire. 2 Des globules blancs lui ont été prélevés et corrigés avec des gènes normaux pour fabriquer l'adénosine désaminase. Ils ont ensuite été réintroduits, réparant efficacement les cellules défectueuses du patient.

In vivo implique l'introduction de matériel génétique directement dans les cellules d'un patient. Pour rendre cette thérapie possible, un vecteur hautement spécifique est nécessaire pour éviter la livraison aux cellules et tissus indésirables, car cela risque une réponse immunitaire. Étant donné que le virus adéno-associé (AAV) peut cibler des types de tissus spécifiques, il est devenu un objectif pour ce type de thérapie génique.

Ce n'est pas simple, cependant, et le développement de la thérapie génique AAV est confronté à un certain nombre de défis. La HPLC peut contribuer à atténuer ces défis grâce à la caractérisation.

L'AAV comme vecteur de thérapie génique

Jesse Gelsinger a été la première personne à mourir dans un essai clinique de thérapie génique. 3 L'enquête sur sa mort a suggéré qu'une infection antérieure par un adénovirus avait provoqué une réaction immunitaire suralimentée envers le vecteur de thérapie génique adénoviral. Avec cette découverte, les recherches futures se sont tournées vers des véhicules de délivrance de gènes contre lesquels les patients n'auraient probablement pas de réaction immunitaire. L'AAV a été identifié comme la réponse et est rapidement devenu l'axe de développement. 3

Il existe de nombreuses variantes différentes du virus qui ont une spécificité tissulaire différente dans le corps, par exemple, certaines pénétreront le tissu cardiaque plus efficacement que d'autres qui pourraient pénétrer dans le cerveau. 3 La différence de sélectivité tissulaire est conférée par les variations des protéines qui forment la capside du virus. Dans le monde entier, ce vecteur est utilisé dans plus de 200 études cliniques en cours pour traiter une grande variété de maladies et de troubles et cette année, la FDA a approuvé la première thérapie génique AAV (Zolgensma) pour un trouble mortel de l'amyotrophie spinale. 3,4

L'AAV est très prometteur et répandu dans les plates-formes les plus couramment utilisées pour la délivrance de gènes dans les études précliniques et cliniques. 4,5 Cependant, le potentiel de la thérapie génique AAV est limité par plusieurs facteurs. Il est petit, ce qui signifie que la taille du gène thérapeutique qu'il peut délivrer est limitée. De plus, malgré les idées initiales, le virus était peu immunogène et des anticorps neutralisants anti-AAV ont été trouvés dans la population générale et les protéines de capside d'AAV elles-mêmes peuvent être immunogènes dans certains cas. 4 La production d'un approvisionnement important peut s'avérer difficile, ce qui est exacerbé par la nécessité d'une forte dose de vecteur hautement purifié pour le traitement.

La thérapie génique AAV est confrontée à de nombreux défis. De plus, les échecs passés des thérapies géniques soulignent la nécessité d'une caractérisation rigoureuse de ces produits avant de passer aux essais cliniques.

Caractérisation des vecteurs AAV

Dans le génome du virus, c'est le casquette et représentant gènes qui contrôlent respectivement la production de capside et la réplication des gènes. Ces gènes sont retirés des vecteurs de thérapie génique afin que le virus ne puisse pas se répliquer lorsqu'il se trouve dans des cellules humaines. 5 Bien que cela soit nécessaire pour la sécurité, cela représente également un défi pour la production de la thérapeutique. Etant donné que le virus ne peut généralement se répliquer qu'en présence d'un autre virus, des gènes &ldquohelper&rdquo sont également nécessaires pendant la production. Il existe plusieurs méthodes utilisées pour ce faire, mais chacune peut conduire à une hétérogénéité considérable au sein des préparations. 5 En raison de la co-expression de ces gènes et du processus d'assemblage viral, des rAAV (AAV recombinants) peuvent être produits sans aucun matériel génétique. Il existe également un risque d'encapsulation de matériel génétique non souhaitable, tel que des gènes viraux, qui est risqué s'il est présent dans la thérapeutique finale. 5

Les exigences de test pour évaluer la sécurité et la pureté de ces produits de thérapie génique sont encore en cours d'établissement, mais certains des principaux paramètres sont répertoriés dans le tableau 1. De toute évidence, avec l'augmentation du nombre de vecteurs AAV entrant dans les essais cliniques, il est nécessaire de développer des tests de contrôle qualité robustes. faire la distinction entre les différentes variantes virales et assurer une production cohérente de ces thérapies. La discussion ci-dessous se concentre sur le rôle de la HPLC dans l'analyse d'échantillons d'AAV pour la thérapie génique.

Tableau 1 Exigences de test pour les produits à base d'AAV (adapté de Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production, Budloo et al, Méthodes et développement clinique, 2018)

De nombreuses impuretés introduites dans l'échantillon d'AAV au cours du processus de purification doivent être soigneusement contrôlées par HPLC. 5 Par exemple, l'iodixanol est souvent utilisé pour la purification par gradient de densité d'AAV. 4 L'iodixanol est un gradient de densité iodé utilisé à l'origine comme composé de contraste aux rayons X à usage clinique. Contrairement à d'autres composés utilisés pour générer des gradients pour la fractionnement, les solutions d'iodixanol sont non ioniques et inertes, de sorte que les fractions d'AAV peuvent être utilisées directement dans l'analyse électrophorétique et les tests d'infectivité virale. 4 Cependant, l'iodixanol est l'un des nombreux réactifs résiduels qui sont des attributs de qualité importants à surveiller dans l'échantillon de vecteur AAV final. Bien qu'il existe déjà une monographie USP pour la quantification de l'iodixanol 6 (et d'autres impuretés résiduelles), le rôle de la HPLC dans d'autres domaines de l'analyse de l'AAV continue d'évoluer.

Pureté et identité de la capside vectorielle

La capside de l'AAV est composée de 3 protéines, VP1, VP2 et VP3. 5 Traditionnellement, l'électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) a été utilisée pour analyser la pureté de ces protéines dans un échantillon viral. 7 Cette méthode consiste à dénaturer les protéines en présence de SDS. Le SDS se lie aux protéines et entraîne une charge négative proportionnelle à la longueur de la chaîne. Les protéines peuvent ensuite être séparées en fonction de la charge dans le gel de polyacrylamide, où un courant électrique est appliqué. Bien qu'il s'agisse d'une technique traditionnelle, la quantification est souvent un processus peu fiable et gourmand en ressources. 7 Étant donné que la chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) est également une méthode de dénaturation, elle est bien adaptée pour remplacer cette méthode pour l'analyse de la pureté des protéines pour les vecteurs viraux. Un bon développement de méthode peut produire une chromatographie qui est beaucoup plus reproductible et permet une quantification robuste. 7 De plus, la RPLC est généralement moins chère et se prête directement à la spectrométrie de masse (MS) en ligne pour l'identification des protéines de capside et des impuretés.

Parallèlement à l'obtention de la pureté de la capside, il est important de caractériser l'identité de la capside pour s'assurer que le bon vecteur a été produit. Traditionnellement, la SDS-PAGE serait combinée avec le western blot, où un anticorps qui se lie à un épitope dans chacune des protéines virales est utilisé pour identifier chaque bande dans la SDS-PAGE. 7 Encore une fois, cela prend du temps et la RPLC peut fournir des techniques quantitatives beaucoup plus fiables. L'utilisation de la cartographie peptidique peut également être utilisée pour détecter des variations dans la séquence protéique qui ne seraient pas reconnues par un test basé sur des anticorps.

Analyse des capsides vides/pleins

Au cours de la production de vecteurs viraux, il y aura une population de particules virales produites qui n'a pas réussi à emballer l'ADN du vecteur (Figure 1). Ces capsides vides représenteront des proportions variables de la récolte brute pour les préparations de rAAV. 5 Une encapsulation incomplète peut également se produire, conduisant à des capsides contenant des génomes tronqués ou un ADN incorrect (c'est-à-dire provenant de plasmides, de cellules ou de virus auxiliaires). 5 Étant donné l'historique des problèmes de réponses du système immunitaire aux vecteurs de thérapie génique, il est important de réduire les sources de matériel potentiellement antigénique inutile, qui pourraient déclencher une réponse immunitaire indésirable. 2 Bien que l'impact de ces espèces ne soit pas entièrement compris, elles sont indésirables et, par conséquent, un attribut de qualité soigneusement réglementé. 5

Un défi pour l'analyse des vecteurs de capside vides/pleins est que l'ADN est protégé par la coquille de capside. Il y a peu de changement de forme/taille entre les particules de capside vides, pleines et partiellement pleines. Par conséquent, le rapport des capsides vides aux capsides pleines est un attribut important à surveiller dans les préparations de vecteurs viraux. Les exigences réglementaires dans ce domaine sont encore en cours d'établissement et il existe un intérêt pour le développement de méthodes HPLC traditionnelles à cette fin. Les méthodes actuelles pour évaluer les capsides sont la microscopie électronique à transmission (MET) et l'ultracentrifugation analytique (AUC). 7 La MET cryogénique implique un échantillon vitrifié par congélation rapide pour préserver la structure d'un échantillon biologique. Lors de l'imagerie, il existe une distinction morphologique claire entre les particules emballées et vides. 7 Étant donné que les capsides vides ont une densité et/ou une masse différentes des particules correctement emballées, elles peuvent être séparées par la force centrifuge. L'AUC est un outil permettant de distinguer et de quantifier différentes espèces d'AAV soit en masse (vitesse de sédimentation) soit en densité (équilibre de sédimentation). Les innovations dans l'AUC signifient qu'il est désormais possible de surveiller plusieurs longueurs d'onde d'absorbance pour quantifier correctement à la fois l'ADN génomique et le contenu de la capside virale en une seule expérience.Le principal avantage de cette technique est qu'elle est reproductible, peut quantifier les particules virales dans le tampon de formulation (pas de préparation d'échantillon), fonctionne indépendamment du variant d'AAV (ou de la taille du transgène), et ne nécessite aucune comparaison standard. 7

Figure 1: exemple de différents assemblages de capsides produits lors de la fabrication de vecteurs AAV

La HPLC a un rôle dans la caractérisation des particules de capside. Des changements de conformation se produisent dans les protéines de la capside pendant l'encapsulation de l'ADN, ce qui provoque une modification de la charge de surface globale sur la particule de capside. 5 Des efforts sont déployés pour utiliser cette différence physicochimique entre les capsides vides/pleins pour développer des méthodes analytiques HPLC d'échange d'ions, bien qu'il soit difficile d'établir une méthode optimale pour toutes les variantes de rAAV car leurs propriétés physicochimiques de capside diffèrent. Cela a conduit à un certain succès car l'AAV est relativement petit pour un virus (20-25 nm), ce qui le rend apte à la fois aux colonnes traditionnelles et monolithiques. Les colonnes monolithiques sont parfois préférées pour traiter de très gros virus et biomolécules car il y a moins de risque de colmatage, des débits plus élevés et moins de forces de cisaillement. 8 Cependant, avec un choix judicieux de la colonne, il n'y a aucune raison pour laquelle la chromatographie par échange d'ions traditionnelle ne peut pas être utilisée pour analyser les particules d'AAV à une échelle analytique. En outre, différentes dimensions de colonne et chimie sont utiles lors du développement de la méthode pour essayer de maximiser la résolution pour différentes variantes. Les particules virales sont sensibles à leur environnement, par exemple, le décapage de la capside est courant à haute température. Par conséquent, il peut être important de valider les résultats d'échange d'ions avec la MET ou l'AUC. En supposant que des résultats précis soient obtenus, la HPLC par échange d'ions pourrait fournir une méthode bon marché, facile et à haut débit de surveillance des assemblages de capsides.

Analyse d'agrégation

En raison de l'immunogénicité des agrégats, la caractérisation est un attribut de qualité critique pour les vecteurs de thérapie génique, comme pour toute thérapie biologique. Les agrégats peuvent varier considérablement de nm (subvisible) à mm (visible) de diamètre et leur formation pendant la production, le stockage et l'expédition peut être causée par de nombreux facteurs. 7 Une seule méthode peut couvrir la large gamme de tailles nécessaires, mais nous pouvons combiner différentes techniques pour évaluer le niveau d'agrégats dans un échantillon. Cela va des techniques de base telles qu'une inspection visuelle à des méthodes telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS), l'AUC, la chromatographie d'exclusion stérique (SEC), la MET et le fractionnement du flux de champ avec diffusion de la lumière statique multi-angle (FFF-MALS). 7

La SEC est particulièrement intéressante pour l'analyse des agrégats car il est peu coûteux de quantifier les agrégats à haut débit. 7 SEC est inhabituel par rapport à d'autres techniques de chromatographie en raison de l'absence d'un mécanisme de rétention. Cependant, des interactions analyte secondaire/phase stationnaire peuvent se produire en raison d'espèces de silanol de surface ou d'interactions hydrophobes. 9 Les interactions secondaires entre un analyte et la colonne sont gênantes pour l'analyse SEC car elles peuvent donner lieu à une forme de pic, une résolution et une récupération médiocres. Lorsqu'il s'agit de grandes biomolécules, le choix de la bonne chimie de la colonne et des bonnes conditions de phase mobile est particulièrement important lors du développement de la méthode. Les interactions secondaires, la température et la colonne SEC elle-même pourraient avoir un impact sur la quantité d'agrégat observée. 9 Cependant, l'utilisation de techniques complémentaires telles que l'AUC devrait donner confiance dans les résultats générés par l'analyse SEC, et les informations biophysiques supplémentaires qu'elle génère soutiennent la production et le développement du processus.

Conclusion

Cet article a décrit certains des problèmes auxquels l'AAV est confronté en tant que vecteur de thérapie génique et certains des différents attributs de sécurité et de qualité qui doivent être pris en compte lors du développement du produit. Les tests AAV posent des défis car les paramètres de ce qui rend un produit de thérapie cellulaire et génique sûr pour les patients sont encore en train d'émerger. En tant qu'expert en chromatographie, Crawford Scientific peut vous assister dans tous les aspects du développement de méthodes HPLC. Nous avons une large gamme de colonnes analytiques de haute qualité adaptées à une large gamme d'applications de biomolécules. Si vous avez besoin de conseils ou si vous rencontrez des problèmes avec l'une des méthodes HPLC décrites ci-dessus, notre équipe technique interne est toujours à votre disposition pour fournir des conseils d'experts à nos clients.

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Stratégies de purification des protéines

Les protéines sont des macromolécules biologiques qui maintiennent l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la cellule, et de nombreuses maladies sont associées à un dysfonctionnement des protéines. La purification des protéines est une étape fondamentale pour analyser les protéines individuelles et les complexes protéiques et identifier les interactions avec d'autres protéines, ADN ou ARN. Il existe une variété de stratégies de purification de protéines pour répondre à l'échelle souhaitée, au débit et aux applications en aval. L'approche optimale doit souvent être déterminée empiriquement.

Purification des protéines

Le meilleur protocole de purification de protéines dépend non seulement de la protéine à purifier, mais également de nombreux autres facteurs tels que la cellule utilisée pour exprimer la protéine recombinante (par exemple, cellules procaryotes contre cellules eucaryotes). Escherichia coli reste le premier choix de nombreux chercheurs pour la production de protéines recombinantes en raison de sa facilité d'utilisation, de sa croissance cellulaire rapide et de son faible coût de culture. Protéines exprimées en E. coli peuvent être purifiées en quantités relativement élevées, mais ces protéines, en particulier les protéines eucaryotes, peuvent ne pas présenter une activité protéique ou un repliement approprié. Les cellules de mammifères cultivées pourraient offrir une meilleure option pour produire des protéines de mammifères correctement repliées et fonctionnelles avec des modifications post-traductionnelles appropriées (Geisse et al. 1996). Cependant, les faibles niveaux d'expression des protéines recombinantes dans les cellules de mammifères en culture présentent un défi pour leur purification. En conséquence, l'obtention d'un rendement et d'une pureté satisfaisants dépend d'une capture hautement sélective et efficace de ces protéines à partir des lysats cellulaires bruts.

Pour simplifier la purification, les étiquettes de purification par affinité peuvent être fusionnées à une protéine recombinante d'intérêt (Nilsson et al. 1997). Les marqueurs de fusion courants sont des polypeptides, de petites protéines ou des enzymes ajoutés à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine recombinante. Les caractéristiques biochimiques des différentes étiquettes influencent la stabilité, la solubilité et l'expression des protéines auxquelles elles sont attachées (Stevens et al. 2001). L'utilisation de vecteurs d'expression qui incluent une étiquette de fusion facilite la purification des protéines recombinantes.

Isolement des complexes protéiques

Un objectif majeur en protéomique est l'élucidation de la fonction des protéines et l'organisation des réseaux complexes qui sont responsables des processus cellulaires clés. L'analyse des interactions protéine:protéine peut fournir des informations précieuses sur les cascades de signalisation cellulaire impliquées dans ces processus, et l'analyse des interactions protéine:acide nucléique révèle souvent des informations importantes sur les processus biologiques tels que la régulation de l'ARNm, le remodelage chromosomique et la transcription. Par exemple, les facteurs de transcription jouent un rôle important dans la régulation de la transcription en se liant à des sites de reconnaissance spécifiques sur le chromosome, souvent au niveau du promoteur d'un gène, et en interagissant avec d'autres protéines du noyau. Cette régulation est nécessaire à la viabilité, à la différenciation et à la croissance cellulaires (Mankan et al. 2009 Mon Dieu et al. 1998).

L'analyse des interactions protéine:protéine nécessite souvent des méthodes simples pour immobiliser les protéines sur des surfaces solides dans des orientations appropriées sans perturber la structure ou la fonction des protéines. Cette immobilisation ne doit pas interférer avec la capacité de liaison et peut être réalisée grâce à l'utilisation de marqueurs d'affinité. L'immobilisation de protéines sur des puces est une approche populaire pour analyser les interactions protéine:ADN et protéine:protéine et identifier les composants des complexes protéiques (Hall et al. 2004 Salle et al. 2007 Hudson et Snyder, 2006). Les puces à protéines fonctionnelles contiennent normalement des protéines fonctionnelles pleine longueur ou des domaines protéiques liés à une surface solide. L'ADN marqué par fluorescence est utilisé pour sonder la puce et identifier les protéines qui se lient à la sonde spécifique. Les puces à protéines fournissent une méthode d'identification à haut débit des interactions protéine:ADN. Les protéines immobilisées peuvent également être utilisées dans des tests de pull-down de protéines pour isoler les partenaires de liaison aux protéines in vivo (cellules de mammifères) ou in vitro. D'autres applications en aval telles que la spectrométrie de masse ne nécessitent pas d'immobilisation des protéines pour identifier les partenaires protéiques et les composants individuels des complexes protéiques.


Quelle est la différence entre la HPLC et la FPLC et pourquoi la FPLC est-elle préférable pour la purification des protéines ? - La biologie

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE - HPLC

La chromatographie liquide haute performance est un puissant outil d'analyse. Cette page examine comment elle est réalisée et montre comment elle utilise les mêmes principes que dans la chromatographie sur couche mince et la chromatographie sur colonne.

Noter: Il est important de lire la page d'introduction sur la chromatographie sur couche mince avant de continuer avec celle-ci - en particulier la partie sur le fonctionnement de la chromatographie sur couche mince. La chromatographie liquide haute performance fonctionne sur le même principe de base. La HPLC est essentiellement une adaptation de la chromatographie sur colonne - il peut donc être judicieux d'y jeter un coup d'œil (très rapide).

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La chromatographie liquide à haute performance est fondamentalement une forme hautement améliorée de chromatographie sur colonne. Au lieu de laisser un solvant s'égoutter à travers une colonne par gravité, il est forcé à travers sous des pressions élevées allant jusqu'à 400 atmosphères. Cela le rend beaucoup plus rapide.

Cela vous permet également d'utiliser une taille de particule beaucoup plus petite pour le matériau de remplissage de la colonne, ce qui donne une surface beaucoup plus grande pour les interactions entre la phase stationnaire et les molécules qui la traversent. Cela permet une bien meilleure séparation des composants du mélange.

L'autre amélioration majeure par rapport à la chromatographie sur colonne concerne les méthodes de détection qui peuvent être utilisées. Ces méthodes sont hautement automatisées et extrêmement sensibles.

La colonne et le solvant

De manière confuse, il existe deux variantes utilisées en HPLC en fonction de la polarité relative du solvant et de la phase stationnaire.

HPLC en phase normale

C'est essentiellement la même chose que vous avez déjà lu dans la chromatographie sur couche mince ou la chromatographie sur colonne. Bien qu'elle soit décrite comme "normale", ce n'est pas la forme de HPLC la plus couramment utilisée.

La colonne est remplie de minuscules particules de silice, et le solvant est non polaire - l'hexane, par exemple. Une colonne typique a un diamètre interne de 4,6 mm (et peut être inférieur à cela) et une longueur de 150 à 250 mm.

Les composés polaires dans le mélange passant à travers la colonne colleront plus longtemps à la silice polaire que les composés non polaires. Les non polaires passeront donc plus rapidement dans la colonne.

HPLC en phase inversée

Dans ce cas, la taille de la colonne est la même, mais la silice est modifiée pour la rendre non polaire en attachant de longues chaînes d'hydrocarbures à sa surface - généralement avec 8 ou 18 atomes de carbone. Un solvant polaire est utilisé - par exemple, un mélange d'eau et d'un alcool tel que le méthanol.

Dans ce cas, il y aura une forte attraction entre le solvant polaire et les molécules polaires dans le mélange passant à travers la colonne. Il n'y aura pas autant d'attraction entre les chaînes hydrocarbonées attachées à la silice (la phase stationnaire) et les molécules polaires de la solution. Les molécules polaires du mélange passeront donc le plus clair de leur temps à se déplacer avec le solvant.

Les composés non polaires dans le mélange auront tendance à former des attractions avec les groupes d'hydrocarbures en raison des forces de dispersion de van der Waals. Ils seront également moins solubles dans le solvant en raison de la nécessité de rompre les liaisons hydrogène lorsqu'ils se faufilent entre les molécules d'eau ou de méthanol, par exemple. Ils passent donc moins de temps en solution dans le solvant et cela les ralentira dans leur cheminement dans la colonne.

Cela signifie que maintenant ce sont les molécules polaires qui traverseront la colonne plus rapidement.

La HPLC en phase inversée est la forme la plus couramment utilisée de HPLC.

Noter: J'ai fait un peu attention à la façon dont j'ai décrit les attractions des molécules non polaires à la surface de la phase stationnaire. En particulier, j'ai évité l'utilisation du mot "adsorpion". L'adsorption se produit lorsqu'une molécule adhère à la surface d'un solide. Surtout si vous aviez de petites molécules dans votre mélange, certaines pourraient se situer entre le long C18 chaînes pour donner ce qui est essentiellement une solution.

On pourrait donc dire que les molécules non polaires étaient plus solubles dans l'hydrocarbure à la surface de la silice qu'elles ne le sont dans le solvant polaire - et donc passer plus de temps dans cette alternative "solvant". Lorsqu'un soluté se divise entre deux solvants différents parce qu'il est plus soluble dans l'un que dans l'autre, nous l'appelons cloison.

Alors est-ce adsorption ou partition ? Vous pouvez argumenter dans les deux sens ! Soyez prêt à le trouver décrit comme l'un ou l'autre.

En regardant l'ensemble du processus

Un schéma de flux pour HPLC

Injection de l'échantillon

L'injection de l'échantillon est entièrement automatisée, et on ne s'attendrait pas à ce que vous sachiez comment cela se fait à ce niveau d'introduction. En raison des pressions exercées, il est ne pas le même qu'en chromatographie en phase gazeuse (si vous avez déjà étudié cela).

Le temps mis par un composé particulier pour traverser la colonne jusqu'au détecteur est connu sous le nom de temps de rétention. Ce temps est mesuré à partir du moment où l'échantillon est injecté jusqu'au point auquel l'écran affiche une hauteur de pic maximale pour ce composé.

Différents composés ont des temps de rétention différents. Pour un composé particulier, le temps de rétention variera en fonction de :

la pression utilisée (car cela affecte le débit du solvant)

la nature de la phase stationnaire (non seulement le matériau dont elle est constituée, mais aussi la taille des particules)

la composition exacte du solvant

la température de la colonne

Cela signifie que les conditions doivent être soigneusement contrôlées si vous utilisez les temps de rétention comme moyen d'identifier les composés.

Il existe plusieurs façons de détecter le passage d'une substance dans la colonne. Une méthode courante et facile à expliquer utilise l'absorption ultraviolette.

De nombreux composés organiques absorbent la lumière UV de différentes longueurs d'onde. Si vous avez un faisceau de lumière UV traversant le flux de liquide sortant de la colonne et un détecteur UV de l'autre côté du flux, vous pouvez obtenir une lecture directe de la quantité de lumière absorbée.

La quantité de lumière absorbée dépendra de la quantité d'un composé particulier qui traverse le faisceau à ce moment-là.

Vous vous demandez peut-être pourquoi les solvants utilisés n'absorbent pas la lumière UV. Ils font! Mais différents composés absorbent le plus fortement dans différentes parties du spectre UV.

Le méthanol, par exemple, absorbe à des longueurs d'onde inférieures à 205 nm et l'eau à des longueurs d'onde inférieures à 190 nm. Si vous utilisiez un mélange méthanol-eau comme solvant, vous devrez donc utiliser une longueur d'onde supérieure à 205 nm pour éviter les fausses lectures du solvant.

Noter: Si vous êtes intéressé, il y a toute une section sur la spectroscopie UV-visible sur le site. Cela explore en détail la question de l'absorption des UV et de la lumière visible par les composés organiques.

Interprétation de la sortie du détecteur

La sortie sera enregistrée sous la forme d'une série de pics - chacun représentant un composé dans le mélange passant à travers le détecteur et absorbant la lumière UV. Tant que vous preniez soin de contrôler les conditions sur la colonne, vous pouviez utiliser les temps de rétention pour aider à identifier les composés présents - à condition, bien sûr, que vous (ou quelqu'un d'autre) les eussiez déjà mesurés pour des échantillons purs des différents composés dans ces conditions identiques.

Mais vous pouvez également utiliser les pics comme moyen de mesurer les quantités de composés présents. Supposons que vous vous intéressiez à un composé particulier, X.

Si vous injectez une solution contenant une quantité connue de X pur dans la machine, non seulement vous pouvez enregistrer son temps de rétention, mais vous pouvez également relier la quantité de X au pic qui s'est formé.

L'aire sous le pic est proportionnelle à la quantité de X qui a passé le détecteur, et cette aire peut être calculée automatiquement par l'ordinateur relié à l'afficheur. La zone qu'il mesurerait est indiquée en vert dans le diagramme (très simplifié).

Si la solution de X était moins concentrée, la zone sous le pic serait moindre - bien que le temps de rétention soit toujours le même. Par exemple:

Cela signifie qu'il est possible de calibrer la machine afin qu'elle puisse être utilisée pour trouver la quantité d'une substance présente - même en très petites quantités.

Attention cependant ! Si vous aviez deux substances différentes dans le mélange (X et Y), pourriez-vous nous dire quelque chose sur leurs quantités relatives ? Pas si vous utilisiez l'absorption UV comme méthode de détection.

Dans le diagramme, la zone sous le pic de Y est inférieure à celle de X. C'est peut-être parce qu'il y a moins de Y que X, mais cela pourrait tout aussi bien être parce que Y absorbe la lumière UV à la longueur d'onde que vous utilisez moins que X. . Il peut y avoir de grandes quantités de Y, mais s'il n'était que faiblement absorbé, cela ne donnerait qu'un petit pic.

Noter: Vous trouverez une vidéo de formation utile sur l'industrie qui décrit tout le processus en suivant ce lien.

La création de liens vers d'autres sites est toujours un peu hasardeuse car les sites changent. Si vous constatez que ce lien ne fonctionne pas, veuillez me contacter via l'adresse figurant sur la page À propos de ce site.

Couplage HPLC à un spectromètre de masse

C'est là que ça devient vraiment malin ! Lorsque le détecteur montre un pic, une partie de ce qui traverse le détecteur à ce moment-là peut être détournée vers un spectromètre de masse. Là, il donnera un modèle de fragmentation qui peut être comparé à une base de données informatique de modèles connus. Cela signifie que l'identité d'une vaste gamme de composés peut être trouvée sans avoir à connaître leurs temps de rétention.

Noter: Si vous avez oublié la spectrométrie de masse, explorez le menu spectrométrie de masse - en particulier le fonctionnement d'un spectromètre de masse et la formation de motifs de fragmentation.

Des questions pour tester votre compréhension

S'il s'agit de la première série de questions que vous posez, veuillez lire la page d'introduction avant de commencer. Vous devrez utiliser le BOUTON RETOUR de votre navigateur pour revenir ici par la suite.


Contenu

La chromatographie, prononcée / ˌ k r oʊ m ə ˈ t ɒ ɡ r ə f i / , est dérivée du grec χρῶμα chrominance, qui signifie "couleur", et γράφειν graphéine, qui signifie "écrire". La combinaison de ces deux termes est directement héritée de l'invention de la technique d'abord utilisée pour séparer les pigments. [3]

La chromatographie a été conçue pour la première fois en Russie par le scientifique d'origine italienne Mikhail Tsvet en 1900. [4] Il a développé la technique, il a inventé chromatographie, dans la première décennie du 20e siècle, principalement pour la séparation des pigments végétaux tels que la chlorophylle, les carotènes et les xanthophylles. Étant donné que ces composants se séparent en bandes de couleurs différentes (respectivement vert, orange et jaune), ils ont directement inspiré le nom de la technique.De nouveaux types de chromatographie développés au cours des années 1930 et 1940 ont rendu la technique utile pour de nombreux processus de séparation. [5]

La technique de chromatographie s'est considérablement développée grâce aux travaux d'Archer John Porter Martin et de Richard Laurence Millington Synge au cours des années 1940 et 1950, pour lesquels ils ont remporté le prix Nobel de chimie en 1952. [6] Ils ont établi les principes et les techniques de base de la chromatographie de partage et leurs travaux ont encouragé le développement rapide de plusieurs méthodes chromatographiques : la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase gazeuse et ce qui allait devenir la chromatographie liquide à haute performance. Depuis lors, la technologie a évolué rapidement. Les chercheurs ont découvert que les grands principes de la chromatographie de Tsvet pouvaient être appliqués de nombreuses manières différentes, résultant en les différentes variétés de chromatographie décrites ci-dessous. Les progrès améliorent continuellement les performances techniques de la chromatographie, permettant la séparation de molécules de plus en plus similaires.

  • Analyte – la substance à séparer lors de la chromatographie. C'est aussi normalement ce qui est nécessaire du mélange.
  • Chromatographie analytique – l'utilisation de la chromatographie pour déterminer l'existence et éventuellement la concentration d'analyte(s) dans un échantillon.
  • Phase collée – une phase stationnaire liée de manière covalente aux particules de support ou à la paroi interne du tube de la colonne.
  • Chromatogramme – le rendement visuel du chromatographe. Dans le cas d'une séparation optimale, différents pics ou motifs sur le chromatogramme correspondent à différents composants du mélange séparé.

La chromatographie est basée sur le concept de coefficient de partage. Tout soluté se partage entre deux solvants non miscibles. Lorsque nous rendons un solvant immobile (par adsorption sur une matrice de support solide) et un autre mobile, il en résulte les applications les plus courantes de la chromatographie. Si le support de matrice, ou phase stationnaire, est polaire (par exemple papier, silice, etc.), il s'agit d'une chromatographie en phase directe, et s'il est non polaire (C-18), il s'agit d'une phase inverse.

Chromatographie sur colonne Modifier

La chromatographie sur colonne est une technique de séparation dans laquelle le lit fixe est à l'intérieur d'un tube. Les particules de la phase stationnaire solide ou du support enrobé d'une phase stationnaire liquide peuvent remplir tout le volume intérieur du tube (colonne garnie) ou être concentrées sur ou le long de la paroi interne du tube en laissant un chemin ouvert et sans restriction pour la phase mobile dans la partie médiane du tube (colonne tubulaire ouverte). Les différences de vitesses de déplacement à travers le milieu sont calculées pour différents temps de rétention de l'échantillon. [8] [9] En 1978, W. Clark Still a introduit une version modifiée de la chromatographie sur colonne appelée chromatographie flash sur colonne (éclat). [10] [11] La technique est très similaire à la chromatographie sur colonne traditionnelle, sauf que le solvant est entraîné à travers la colonne en appliquant une pression positive. Cela a permis d'effectuer la plupart des séparations en moins de 20 minutes, avec des séparations améliorées par rapport à l'ancienne méthode. Les systèmes de chromatographie flash modernes sont vendus sous forme de cartouches en plastique pré-emballées, et le solvant est pompé à travers la cartouche. Les systèmes peuvent également être reliés à des détecteurs et des collecteurs de fractions assurant l'automatisation. L'introduction de pompes à gradient a entraîné des séparations plus rapides et une utilisation moindre de solvant.

Dans l'adsorption en lit expansé, un lit fluidisé est utilisé, plutôt qu'une phase solide constituée d'un lit tassé. Cela permet d'omettre les étapes de compensation initiales telles que la centrifugation et la filtration, pour les bouillons de culture ou les suspensions de cellules brisées.

La chromatographie sur phosphocellulose utilise l'affinité de liaison de nombreuses protéines de liaison à l'ADN pour la phosphocellulose. Plus l'interaction d'une protéine avec l'ADN est forte, plus la concentration en sel nécessaire pour éluer cette protéine est élevée. [12]

Chromatographie planaire Modifier

Chromatographie planaire est une technique de séparation dans laquelle la phase stationnaire est présente sous forme ou sur un plan. Le plan peut être un papier, servant tel quel ou imprégné par une substance comme le lit fixe (chromatographie sur papier) ou une couche de particules solides étalées sur un support tel qu'une plaque de verre (chromatographie sur couche mince). Différents composés dans le mélange d'échantillons parcourent des distances différentes selon la force avec laquelle ils interagissent avec la phase stationnaire par rapport à la phase mobile. Le facteur de rétention spécifique (RF) de chaque produit chimique peut être utilisé pour faciliter l'identification d'une substance inconnue.

Chromatographie sur papier Modifier

La chromatographie sur papier est une technique qui consiste à placer un petit point ou une ligne de solution échantillon sur une bande de papier de chromatographie. Le papier est placé dans un récipient avec une couche peu profonde de solvant et scellé. Au fur et à mesure que le solvant monte à travers le papier, il rencontre le mélange échantillon, qui commence à remonter le papier avec le solvant. Ce papier est fait de cellulose, une substance polaire, et les composés contenus dans le mélange voyagent plus loin s'ils sont moins polaires. Les substances plus polaires se lient plus rapidement au papier cellulosique et ne voyagent donc pas aussi loin.

Chromatographie sur couche mince (CCM) Modifier

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique de laboratoire largement utilisée pour séparer différents produits biochimiques sur la base de leurs attractions relatives aux phases stationnaire et mobile. C'est similaire à la chromatographie sur papier. Cependant, au lieu d'utiliser une phase stationnaire de papier, il s'agit d'une phase stationnaire d'une fine couche d'adsorbant comme du gel de silice, de l'alumine ou de la cellulose sur un substrat plat et inerte. La TLC est très polyvalente, plusieurs échantillons peuvent être séparés simultanément sur la même couche, ce qui la rend très utile pour les applications de dépistage telles que le test des niveaux de médicament et de la pureté de l'eau. [13] La possibilité de contamination croisée est faible puisque chaque séparation est effectuée sur une nouvelle couche. Par rapport au papier, il présente l'avantage de cycles plus rapides, de meilleures séparations, de meilleures analyses quantitatives et le choix entre différents adsorbants. Pour une résolution encore meilleure et une séparation plus rapide qui utilise moins de solvant, une CCM haute performance peut être utilisée. Une utilisation populaire plus ancienne consistait à différencier les chromosomes en observant la distance dans le gel (la séparation des était une étape distincte).

Le principe de base de la chromatographie par déplacement est le suivant : Une molécule avec une affinité élevée pour la matrice de chromatographie (le déplaceur) entre en compétition efficacement pour les sites de liaison, et déplace ainsi toutes les molécules avec des affinités moindres. [14] Il existe des différences distinctes entre la chromatographie de déplacement et la chromatographie d'élution. En mode d'élution, les substances émergent généralement d'une colonne en pics gaussiens étroits. Une large séparation des pics, de préférence jusqu'à la ligne de base, est souhaitée pour une purification maximale. La vitesse à laquelle tout composant d'un mélange descend dans la colonne en mode d'élution dépend de nombreux facteurs. Mais pour que deux substances se déplacent à des vitesses différentes et soient ainsi résolues, il doit y avoir des différences substantielles dans certaines interactions entre les biomolécules et la matrice de chromatographie. Les paramètres de fonctionnement sont ajustés pour maximiser l'effet de cette différence. Dans de nombreux cas, la séparation de la ligne de base des pics ne peut être obtenue qu'avec une élution par gradient et de faibles charges de colonne. Ainsi, deux inconvénients de la chromatographie en mode d'élution, en particulier à l'échelle préparative, sont la complexité opérationnelle, due au pompage par gradient de solvant, et le faible débit, dû aux faibles charges de colonne. La chromatographie par déplacement présente des avantages par rapport à la chromatographie d'élution en ce que les composants sont résolus en zones consécutives de substances pures plutôt qu'en "pics". Parce que le procédé tire parti de la non-linéarité des isothermes, une alimentation de colonne plus importante peut être séparée sur une colonne donnée avec les composants purifiés récupérés à des concentrations significativement plus élevées.

Chromatographie en phase gazeuse Modifier

La chromatographie en phase gazeuse (GC), également parfois appelée chromatographie gaz-liquide (GLC), est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un gaz. La séparation par chromatographie en phase gazeuse est toujours effectuée dans une colonne, qui est typiquement « remplie » ou « capillaire ». Les colonnes remplies sont les chevaux de bataille de la chromatographie en phase gazeuse, étant moins chères et plus faciles à utiliser et offrant souvent des performances adéquates. Les colonnes capillaires donnent généralement une résolution bien supérieure et bien que plus chères, elles sont de plus en plus utilisées, en particulier pour les mélanges complexes. En outre, les colonnes capillaires peuvent être divisées en trois classes : les colonnes tubulaires ouvertes à couche poreuse (PLOT), les colonnes tubulaires ouvertes à revêtement mural (WCOT) et les colonnes tubulaires ouvertes à revêtement de support (SCOT). Les colonnes PLOT sont uniques en ce sens que la phase stationnaire est adsorbée sur les parois de la colonne, tandis que les colonnes WCOT ont une phase stationnaire qui est chimiquement liée aux parois. Les colonnes SCOT sont en quelque sorte la combinaison des deux types mentionnés de telle sorte qu'elles ont des particules de support qui adhèrent aux parois de la colonne, mais ces particules ont une phase liquide chimiquement liée sur elles. [15] Les deux types de colonnes sont fabriqués à partir de matériaux non adsorbants et chimiquement inertes. L'acier inoxydable et le verre sont les matériaux habituels pour les colonnes garnies et le quartz ou la silice fondue pour les colonnes capillaires.

La chromatographie en phase gazeuse est basée sur un équilibre de partage d'analyte entre une phase stationnaire liquide solide ou visqueuse (souvent un matériau liquide à base de silicone) et un gaz mobile (le plus souvent de l'hélium). La phase stationnaire est collée à l'intérieur d'un tube en verre ou en silice fondue de petit diamètre (généralement de 0,53 à 0,18 mm de diamètre intérieur) (une colonne capillaire) ou d'une matrice solide à l'intérieur d'un tube métallique plus grand (une colonne garnie). Il est largement utilisé en chimie analytique bien que les températures élevées utilisées en GC le rendent inadapté aux biopolymères ou aux protéines de haut poids moléculaire (la chaleur les dénature), fréquemment rencontrés en biochimie, il est bien adapté pour une utilisation dans la pétrochimie, la surveillance environnementale et la dépollution, et les domaines de la chimie industrielle. Il est également largement utilisé dans la recherche en chimie.

Chromatographie liquide Modifier

La chromatographie liquide (LC) est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un liquide. Elle peut être réalisée soit dans une colonne, soit dans un plan. La chromatographie liquide actuelle qui utilise généralement de très petites particules de garnissage et une pression relativement élevée est appelée chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

En HPLC, l'échantillon est forcé par un liquide à haute pression (la phase mobile) à travers une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de particules de forme irrégulière ou sphérique, d'une couche monolithique poreuse ou d'une membrane poreuse. La HPLC est historiquement divisée en deux sous-classes différentes en fonction de la polarité des phases mobile et stationnaire. Les méthodes dans lesquelles la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile (par exemple, le toluène comme phase mobile, la silice comme phase stationnaire) sont appelées chromatographie liquide en phase normale (NPLC) et l'inverse (par exemple, le mélange eau-méthanol comme et C18 (octadécylsilyle) comme phase stationnaire) est appelée chromatographie liquide en phase inverse (RPLC).

Les techniques spécifiques sous cette rubrique générale sont énumérées ci-dessous.

La chromatographie d'affinité [16] est basée sur une interaction sélective non covalente entre un analyte et des molécules spécifiques. C'est très spécifique, mais pas très robuste. Il est souvent utilisé en biochimie dans la purification de protéines liées à des tags. Ces protéines de fusion sont marquées avec des composés tels que des balises His, de la biotine ou des antigènes, qui se lient spécifiquement à la phase stationnaire. Après purification, certains de ces marqueurs sont généralement retirés et la protéine pure est obtenue.

La chromatographie d'affinité utilise souvent l'affinité d'une biomolécule pour un métal (Zn, Cu, Fe, etc.). Les colonnes sont souvent préparées manuellement. Les colonnes d'affinité traditionnelles sont utilisées comme étape préparatoire pour éliminer les biomolécules indésirables.

Cependant, il existe des techniques HPLC qui utilisent des propriétés de chromatographie d'affinité. La chromatographie d'affinité avec un métal immobilisé (IMAC) [17] [18] est utile pour séparer les molécules susmentionnées en fonction de l'affinité relative pour le métal (c'est-à-dire Dionex IMAC). Souvent, ces colonnes peuvent être chargées avec différents métaux pour créer une colonne avec une affinité ciblée. [19]

Chromatographie en fluide supercritique Modifier

La chromatographie en phase fluide supercritique est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un fluide au-dessus et relativement proche de sa température et pression critiques.

Chromatographie d'échange d'ions Modifier

La chromatographie d'échange d'ions (généralement appelée chromatographie d'ions) utilise un mécanisme d'échange d'ions pour séparer les analytes en fonction de leurs charges respectives. Elle est généralement réalisée en colonnes mais peut également être utile en mode planaire. La chromatographie par échange d'ions utilise une phase stationnaire chargée pour séparer les composés chargés, notamment les anions, les cations, les acides aminés, les peptides et les protéines. Dans les méthodes conventionnelles, la phase stationnaire est une résine échangeuse d'ions qui porte des groupes fonctionnels chargés qui interagissent avec des groupes de charges opposées du composé à retenir. Il existe deux types de chromatographie échangeuse d'ions : l'échange de cations et l'échange d'anions. Dans la chromatographie d'échange de cations, la phase stationnaire a une charge négative et l'ion échangeable est un cation, tandis que, dans la chromatographie d'échange d'anions, la phase stationnaire a une charge positive et l'ion échangeable est un anion. [20] La chromatographie d'échange d'ions est couramment utilisée pour purifier des protéines en utilisant la FPLC.

Chromatographie d'exclusion stérique Modifier

La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est également connue sous le nom de chromatographie par perméation de gel (GPC) ou chromatographie de filtration sur gel et sépare les molécules selon leur taille (ou plus précisément selon leur diamètre hydrodynamique ou leur volume hydrodynamique). Les molécules plus petites sont capables de pénétrer dans les pores du support et, par conséquent, les molécules sont piégées et retirées du flux de la phase mobile. Le temps de séjour moyen dans les pores dépend de la taille effective des molécules d'analyte. Cependant, les molécules qui sont plus grandes que la taille moyenne des pores du garnissage sont exclues et ne subissent donc pratiquement aucune rétention, ces espèces sont les premières à être éluées. Il s'agit généralement d'une technique de chromatographie à basse résolution et elle est donc souvent réservée à l'étape finale de "polissage" d'une purification. Elle est également utile pour déterminer la structure tertiaire et la structure quaternaire de protéines purifiées, d'autant plus qu'elle peut être réalisée dans des conditions de solution native.

Séparation chromatographique par adsorption sur lit expansé Modifier

Une colonne d'adsorption chromatographique sur lit expansé (EBA) pour un procédé de séparation biochimique comprend un distributeur de liquide d'équilibrage de pression ayant une fonction d'autonettoyage sous une plaque de tamis de blocage poreux au fond du lit expansé, un ensemble buse de partie supérieure ayant une fonction de nettoyage à contre-courant au sommet du lit expansé, une meilleure répartition de la liqueur de charge ajoutée dans le lit expansé garantissant que le fluide traversant la couche de lit expansé présente un état d'écoulement piston. La couche de lit expansé affiche un état d'écoulement de piston. La colonne de séparation chromatographique à lit expansé présente l'avantage d'augmenter l'efficacité de séparation du lit expansé.

La chromatographie d'adsorption sur lit expansé (EBA) est une technique pratique et efficace pour la capture de protéines directement à partir d'un échantillon brut non clarifié. En chromatographie EBA, le lit décanté est d'abord étendu par un flux ascendant de tampon d'équilibrage. La charge brute, un mélange de protéines solubles, de contaminants, de cellules et de débris cellulaires, est ensuite passée vers le haut à travers le lit expansé. Les protéines cibles sont capturées sur l'adsorbant, tandis que les particules et les contaminants passent à travers. Un changement de tampon d'élution tout en maintenant un flux ascendant entraîne une désorption de la protéine cible en mode lit expansé. Alternativement, si le flux est inversé, les particules adsorbées se déposent rapidement et les protéines peuvent être désorbées par un tampon d'élution. Le mode d'élution (lit expansé versus lit décanté) dépend des caractéristiques de la charge. Après l'élution, l'adsorbant est nettoyé avec une solution de nettoyage en place (NEP) prédéfinie, avec un nettoyage suivi d'une régénération de la colonne (pour une utilisation ultérieure) ou d'un stockage.

Chromatographie en phase inversée Modifier

La chromatographie en phase inverse (RPC) est toute procédure de chromatographie liquide dans laquelle la phase mobile est significativement plus polaire que la phase stationnaire. Il est ainsi nommé car en chromatographie liquide en phase normale, la phase mobile est nettement moins polaire que la phase stationnaire. Les molécules hydrophobes dans la phase mobile ont tendance à s'adsorber sur la phase stationnaire relativement hydrophobe. Les molécules hydrophiles dans la phase mobile auront tendance à s'éluer en premier. Les colonnes de séparation comprennent typiquement une chaîne carbonée en C8 ou C18 liée à un substrat de particules de silice.

Chromatographie d'interaction hydrophobe Modifier

Les interactions hydrophobes entre les protéines et la matrice chromatographique peuvent être exploitées pour purifier les protéines. Dans la chromatographie d'interaction hydrophobe, le matériau de la matrice est légèrement substitué par des groupes hydrophobes. Ces groupes peuvent aller des groupes méthyle, éthyle, propyle, octyle ou phényle. [21] À des concentrations élevées de sel, les chaînes latérales non polaires à la surface des protéines « interagissent » avec les groupes hydrophobes, c'est-à-dire que les deux types de groupes sont exclus par le solvant polaire (les effets hydrophobes sont augmentés par l'augmentation de la force ionique). Ainsi, l'échantillon est déposé sur la colonne dans un tampon fortement polaire. L'éluant est typiquement un tampon aqueux avec des concentrations de sel décroissantes, des concentrations croissantes de détergent (qui perturbent les interactions hydrophobes) ou des changements de pH.

En général, la chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) est avantageuse si l'échantillon est sensible aux changements de pH ou aux solvants agressifs généralement utilisés dans d'autres types de chromatographie, mais pas à des concentrations élevées de sel. Généralement, c'est la quantité de sel dans le tampon qui est variée. En 2012, Müller et Franzreb ont décrit les effets de la température sur le HIC en utilisant l'albumine sérique bovine (BSA) avec quatre types différents de résine hydrophobe. L'étude a modifié la température de manière à affecter l'affinité de liaison de la BSA sur la matrice. Il a été conclu que le cycle de température de 50 à 10 degrés ne serait pas adéquat pour laver efficacement tout le BSA de la matrice, mais pourrait être très efficace si la colonne n'était utilisée que quelques fois. [22] L'utilisation de la température pour effectuer le changement permet aux laboratoires de réduire les coûts d'achat de sel et d'économiser de l'argent.

Si des concentrations élevées de sel ainsi que des fluctuations de température doivent être évitées, vous pouvez utiliser un matériau plus hydrophobe pour rivaliser avec votre échantillon afin de l'éluer. [source] Cette méthode dite indépendante du sel de HIC a montré un isolement direct de l'immunoglobuline humaine G (IgG) à partir du sérum avec un rendement satisfaisant et a utilisé la bêta-cyclodextrine comme compétiteur pour déplacer les IgG de la matrice. [23] Cela ouvre largement la possibilité d'utiliser HIC avec des échantillons sensibles au sel, car nous savons que des concentrations élevées de sel précipitent les protéines.

Chromatographie hydrodynamique Modifier

La chromatographie hydrodynamique (HDC) est dérivée du phénomène observé selon lequel les grosses gouttelettes se déplacent plus rapidement que les petites. [24] Dans une colonne, cela se produit parce que le centre de masse des plus grosses gouttelettes ne peut pas être aussi proche des côtés de la colonne que les plus petites gouttelettes en raison de leur plus grande taille globale.[25] Les plus grosses gouttelettes élueront d'abord à partir du milieu de la colonne tandis que les plus petites gouttelettes adhéreront aux côtés de la colonne et s'élueront en dernier. Cette forme de chromatographie est utile pour séparer les analytes par masse molaire, taille, forme et structure lorsqu'elle est utilisée conjointement avec des détecteurs de diffusion de lumière, des viscosimètres et des réfractomètres. [26] Les deux principaux types de HDC sont les tubes ouverts et les colonnes garnies. Le tube ouvert offre des temps de séparation rapides pour les petites particules, tandis que la colonne à garnissage HDC peut augmenter la résolution et convient mieux aux particules d'une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 5 > daltons. [27] La ​​HDC diffère des autres types de chromatographie car la séparation n'a lieu que dans le volume interstitiel, qui est le volume entourant et entre les particules dans une colonne garnie. [28]

La HDC partage le même ordre d'élution que la chromatographie d'exclusion de taille (SEC), mais les deux processus varient encore à bien des égards. [27] Dans une étude comparant les deux types de séparation, Isenberg, Brewer, Côté et Striegel utilisent les deux méthodes pour la caractérisation des polysaccharides et concluent que la HDC couplée à la diffusion de la lumière multiangle (MALS) permet d'obtenir une distribution de masse molaire plus précise par rapport à off- ligne MALS que SEC en beaucoup moins de temps. [29] Ceci est largement dû au fait que la SEC est une technique plus destructrice en raison des pores de la colonne dégradant l'analyte pendant la séparation, ce qui a tendance à avoir un impact sur la distribution de masse. [29] Cependant, le principal inconvénient de la HDC est la faible résolution des pics d'analyte, ce qui fait de la SEC une option plus viable lorsqu'elle est utilisée avec des produits chimiques qui ne sont pas facilement dégradables et où l'élution rapide n'est pas importante. [30]

La HDC joue un rôle particulièrement important dans le domaine de la microfluidique. Le premier appareil réussi pour le système HDC-on-a-chip a été proposé par Chmela et al. en 2002. [31] Leur conception a permis de réaliser des séparations à l'aide d'un canal de 80 mm de long sur une échelle de temps de 3 minutes pour des particules de diamètres allant de 26 à 110 nm, mais les auteurs ont exprimé le besoin d'améliorer les paramètres de rétention et de dispersion. [31] Dans une publication de 2010 de Jellema, Markesteijn, Westerweel et Verpoorte, la mise en œuvre de la HDC avec un flux bidirectionnel en recirculation a entraîné une séparation haute résolution basée sur la taille avec seulement un canal de 3 mm de long. [32] Le fait d'avoir un canal aussi court et une résolution élevée était considéré comme particulièrement impressionnant étant donné que les études précédentes utilisaient des canaux de 80 mm de long. [31] Pour une application biologique, en 2007, Huh, et al. a proposé un dispositif de tri microfluidique basé sur la HDC et la gravité, utile pour empêcher les particules potentiellement dangereuses de diamètre supérieur à 6 microns de pénétrer dans la circulation sanguine lors de l'injection d'agents de contraste en échographie. [33] Cette étude a également fait des progrès en matière de durabilité environnementale en microfluidique en raison du manque d'électronique extérieure entraînant le flux, ce qui était un avantage de l'utilisation d'un dispositif basé sur la gravité.

Chromatographie bidimensionnelle Modifier

Dans certains cas, la sélectivité fournie par l'utilisation d'une colonne peut être insuffisante pour assurer la résolution des analytes dans des échantillons complexes. La chromatographie bidimensionnelle vise à augmenter la résolution de ces pics en utilisant une seconde colonne aux propriétés physico-chimiques (classification chimique) différentes. [34] [35] Le mécanisme de rétention sur ce nouveau support solide étant différent de la séparation en première dimension, il peut être possible de séparer par chromatographie bidimensionnelle des composés indiscernables par chromatographie unidimensionnelle. De plus, la séparation sur la deuxième dimension se produit plus rapidement que sur la première dimension. [34] Un exemple d'une séparation TLC bidimensionnelle est l'endroit où l'échantillon est repéré à un coin d'une plaque carrée, développé, séché à l'air, puis tourné de 90° et généralement redéveloppé dans un second système de solvant. La chromatographie bidimensionnelle peut être appliquée aux séparations GC ou LC. [34] [35] Cette méthode de séparation peut également être utilisée dans une approche coupante, [36] où des régions d'intérêt spécifiques sur la première dimension sont sélectionnées pour la séparation par la deuxième dimension, ou dans une approche globale, [34] [35] où tous les analytes de la première dimension subissent la séparation de la deuxième dimension.

Chromatographie en lit mobile simulé Modifier

La technique du lit mobile simulé (SMB) est une variante de la chromatographie liquide haute performance, elle est utilisée pour séparer des particules et/ou des composés chimiques qui seraient difficiles ou impossibles à résoudre autrement. Cette séparation accrue est provoquée par un agencement de vannes et de colonnes qui est utilisé pour allonger indéfiniment la phase stationnaire. Dans la technique du lit mobile de la chromatographie préparative, l'entrée de l'alimentation et la récupération de l'analyte sont simultanées et continues, mais en raison des difficultés pratiques avec un lit en mouvement continu, la technique du lit mobile simulé a été proposée. Dans la technique du lit mobile simulé, au lieu de déplacer le lit, les positions d'entrée d'échantillon et de sortie d'analyte sont déplacées en continu, donnant l'impression d'un lit mobile. La véritable chromatographie en lit mobile (TMBC) n'est qu'un concept théorique. Sa simulation, SMBC, est obtenue grâce à l'utilisation d'une multiplicité de colonnes en série et d'un agencement de vannes complexe, qui permet l'alimentation en échantillon et en solvant, ainsi qu'un prélèvement d'analyte et de déchets aux emplacements appropriés de n'importe quelle colonne, ce qui permet une commutation à intervalles réguliers. l'entrée de l'échantillon dans une direction, l'entrée du solvant dans la direction opposée, tout en modifiant de manière appropriée les positions de prélèvement de l'analyte et des déchets.

Chromatographie en phase gazeuse par pyrolyse Modifier

La pyrolyse-chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse est une méthode d'analyse chimique dans laquelle l'échantillon est chauffé jusqu'à décomposition pour produire des molécules plus petites qui sont séparées par chromatographie en phase gazeuse et détectées à l'aide de la spectrométrie de masse.

La pyrolyse est la décomposition thermique de matériaux dans une atmosphère inerte ou sous vide. L'échantillon est mis en contact direct avec un fil de platine, ou placé dans un tube à échantillon en quartz, et rapidement chauffé à 600-1000 °C. Selon l'application, des températures encore plus élevées sont utilisées. Trois techniques de chauffage différentes sont utilisées dans les pyrolyseurs réels : le four isotherme, le chauffage inductif (filament Curie Point) et le chauffage résistif utilisant des filaments de platine. Les grosses molécules se clivent à leurs points les plus faibles et produisent des fragments plus petits et plus volatils. Ces fragments peuvent être séparés par chromatographie en phase gazeuse. Les chromatogrammes de pyrolyse GC sont généralement complexes car une large gamme de produits de décomposition différents est formée. Les données peuvent être utilisées comme empreintes digitales pour prouver l'identité du matériau ou les données GC/MS sont utilisées pour identifier des fragments individuels afin d'obtenir des informations structurelles. Pour augmenter la volatilité des fragments polaires, divers réactifs de méthylation peuvent être ajoutés à un échantillon avant la pyrolyse.

Outre l'utilisation de pyrolyseurs dédiés, la pyrolyse GC d'échantillons solides et liquides peut être effectuée directement à l'intérieur des injecteurs de vaporisateurs à température programmable (PTV) qui fournissent un chauffage rapide (jusqu'à 30 °C/s) et des températures maximales élevées de 600 à 650 °C. Ceci est suffisant pour certaines applications de pyrolyse. Le principal avantage est qu'aucun instrument dédié ne doit être acheté et que la pyrolyse peut être effectuée dans le cadre d'une analyse GC de routine. Dans ce cas, des revêtements d'entrée GC en quartz doivent être utilisés. Des données quantitatives peuvent être acquises et de bons résultats de dérivatisation à l'intérieur de l'injecteur PTV sont également publiés.

Chromatographie liquide rapide des protéines Modifier

La chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) est une forme de chromatographie liquide souvent utilisée pour analyser ou purifier des mélanges de protéines. Comme dans d'autres formes de chromatographie, la séparation est possible car les différents composants d'un mélange ont des affinités différentes pour deux matériaux, un fluide en mouvement (la "phase mobile") et un solide poreux (la phase stationnaire). En FPLC, la phase mobile est une solution aqueuse, ou "tampon". Le débit du tampon est contrôlé par une pompe volumétrique et est normalement maintenu constant, tandis que la composition du tampon peut être modifiée en puisant des fluides dans des proportions différentes à partir de deux ou plusieurs réservoirs externes. La phase stationnaire est une résine composée de billes, généralement d'agarose réticulé, conditionnées dans une colonne cylindrique en verre ou en plastique. Les résines FPLC sont disponibles dans une large gamme de tailles de billes et de ligands de surface en fonction de l'application.

Chromatographie à contre-courant Modifier

La chromatographie à contre-courant (CCC) est un type de chromatographie liquide-liquide, où les phases stationnaire et mobile sont des liquides et la phase stationnaire liquide est maintenue stagnante par une forte force centrifuge.

Chromatographie hydrodynamique à contre-courant (CCC) Modifier

Le principe de fonctionnement de l'instrument CCC nécessite une colonne constituée d'un tube ouvert enroulé autour d'une bobine. La bobine est tournée dans un mouvement giratoire à double axe (un cardioïde), ce qui fait qu'un champ de gravité variable (G) agit sur la colonne pendant chaque rotation. Ce mouvement amène la colonne à voir une étape de partage par tour et les composants de l'échantillon se séparent dans la colonne en raison de leur coefficient de partage entre les deux phases liquides non miscibles utilisées. Il existe de nombreux types de CCC disponibles aujourd'hui. Ceux-ci incluent HSCCC (CCC haute vitesse) et HPCCC (CCC haute performance). HPCCC est la version la plus récente et la plus performante de l'instrumentation disponible actuellement.

Chromatographie hydrostatique à contre-courant ou chromatographie de partage centrifuge (CPC) Modifier

Dans l'instrument CPC, la colonne se compose d'une série de cellules interconnectées par des conduits attachés à un rotor. Ce rotor tourne sur son axe central créant le champ centrifuge nécessaire pour maintenir la phase stationnaire en place. Le processus de séparation dans le CPC est régi uniquement par le partage des solutés entre les phases stationnaire et mobile, mécanisme qui peut être facilement décrit à l'aide des coefficients de partage (K) de solutés. Les instruments CPC sont disponibles dans le commerce pour les séparations en laboratoire, à l'échelle pilote et à l'échelle industrielle avec différentes tailles de colonnes allant d'environ 10 millilitres à 10 litres de volume.

Chromatographie périodique à contre-courant Modifier

Contrairement à la chromatographie à contre-courant (voir ci-dessus), la chromatographie périodique à contre-courant (PCC) utilise une phase stationnaire solide et uniquement une phase mobile liquide. Elle s'apparente donc beaucoup plus à la chromatographie d'affinité classique qu'à la chromatographie à contre-courant. PCC utilise plusieurs colonnes qui, pendant la phase de chargement, sont connectées en ligne. Ce mode permet de surcharger la première colonne de cette série sans perdre de produit, qui traverse déjà la colonne avant que la résine ne soit complètement saturée. Le produit de rupture est capturé sur la ou les colonnes suivantes. Dans une étape suivante, les colonnes sont déconnectées les unes des autres. La première colonne est lavée et éluée, tandis que les autres colonnes sont encore en cours de chargement. Une fois que la première colonne (initialement) est rééquilibrée, elle est réintroduite dans le flux de chargement, mais en tant que dernière colonne. Le processus se poursuit alors de façon cyclique.

Chromatographie chirale Modifier

La chromatographie chirale implique la séparation des stéréoisomères. Dans le cas des énantiomères, ceux-ci n'ont aucune différence chimique ou physique en dehors d'être des images miroir tridimensionnelles. La chromatographie conventionnelle ou d'autres procédés de séparation sont incapables de les séparer. Pour permettre les séparations chirales, la phase mobile ou la phase stationnaire doivent elles-mêmes être rendues chirales, ce qui donne des affinités différentes entre les analytes. Des colonnes HPLC de chromatographie chirale (avec une phase stationnaire chirale) en phase normale et inversée sont disponibles dans le commerce.


Comment fonctionne la chromatographie liquide haute performance ?

Les composants d'un système de chromatographie liquide à haute performance [HPLC] de base sont illustrés dans le diagramme simple de la figure E.

Un réservoir contient le solvant [appelé phase mobile, car il se déplace]. Une pompe haute pression [système de distribution de solvant ou gestionnaire de solvant] est utilisée pour générer et doser un débit spécifié de phase mobile, généralement en millilitres par minute. Un injecteur [gestionnaire d'échantillons ou passeur d'échantillons] est capable d'introduire [injecter] l'échantillon dans le flux de phase mobile à écoulement continu qui transporte l'échantillon dans la colonne HPLC. La colonne contient le matériau de garnissage chromatographique nécessaire pour effectuer la séparation. Ce matériau de garnissage est appelé phase stationnaire car il est maintenu en place par le matériel de la colonne. Un détecteur est nécessaire pour voir les bandes de composés séparées lorsqu'elles éluent de la colonne HPLC [la plupart des composés n'ont pas de couleur, nous ne pouvons donc pas les voir avec nos yeux]. La phase mobile sort du détecteur et peut être mise au rebut ou collectée, au choix. Lorsque la phase mobile contient une bande de composé séparée, la HPLC permet de collecter cette fraction de l'éluat contenant ce composé purifié pour une étude plus approfondie. C'est ce qu'on appelle la chromatographie préparative [discutée dans la section sur l'échelle HPLC].

Notez que des tubes et des raccords haute pression sont utilisés pour interconnecter les composants de la pompe, de l'injecteur, de la colonne et du détecteur afin de former le conduit pour la phase mobile, l'échantillon et les bandes composées séparées.

Figure E : Système de chromatographie liquide haute performance [HPLC]

Le détecteur est câblé à la station de données informatique, le composant du système HPLC qui enregistre le signal électrique nécessaire pour générer le chromatogramme sur son écran et pour identifier et quantifier la concentration des constituants de l'échantillon (voir Figure F). Étant donné que les caractéristiques des composés de l'échantillon peuvent être très différentes, plusieurs types de détecteurs ont été développés. Par exemple, si un composé peut absorber la lumière ultraviolette, un détecteur d'absorbance UV est utilisé. Si le composé émet une fluorescence, un détecteur de fluorescence est utilisé. Si le composé ne présente aucune de ces caractéristiques, un type de détecteur plus universel est utilisé, tel qu'un détecteur à diffusion de lumière par évaporation [ELSD]. L'approche la plus puissante est l'utilisation de plusieurs détecteurs en série. Par exemple, un détecteur UV et/ou ELSD peut être utilisé en combinaison avec un spectromètre de masse [MS] pour analyser les résultats de la séparation chromatographique. Cela fournit, à partir d'une seule injection, des informations plus complètes sur un analyte. La pratique consistant à coupler un spectromètre de masse à un système HPLC est appelée LC/MS.

Figure F : Un système HPLC typique [Waters Alliance]

Opération HPLC
Un moyen simple de comprendre comment nous réalisons la séparation des composés contenus dans un échantillon est de visualiser le diagramme de la figure G.

La phase mobile entre dans la colonne par la gauche, traverse le lit de particules et sort par la droite. Le sens du flux est représenté par des flèches vertes. Tout d'abord, considérons l'image du haut, elle représente la colonne au temps zéro [le moment de l'injection], lorsque l'échantillon entre dans la colonne et commence à former une bande. L'échantillon montré ici, un mélange de colorants jaunes, rouges et bleus, apparaît à l'entrée de la colonne sous la forme d'une seule bande noire. [En réalité, cet échantillon pourrait être tout ce qui peut être dissous dans un solvant, généralement les composés seraient incolores et la paroi de la colonne opaque, nous aurions donc besoin d'un détecteur pour voir les composés séparés lorsqu'ils éluent.]

Après quelques minutes [image du bas], au cours desquelles la phase mobile s'écoule de manière continue et régulière devant les particules de matériau de garnissage, nous pouvons voir que les colorants individuels se sont déplacés dans des bandes séparées à des vitesses différentes. En effet, il existe une compétition entre la phase mobile et la phase stationnaire pour attirer chacun des colorants ou analytes. Notez que la bande de colorant jaune se déplace le plus rapidement et est sur le point de sortir de la colonne. Le colorant jaune aime [est attiré par] la phase mobile plus que les autres colorants. Par conséquent, il se déplace à une plus rapide vitesse, plus proche de celle de la phase mobile. La bande de colorant bleu aime plus le matériau d'emballage que la phase mobile. Sa plus forte attraction pour les particules l'amène à se déplacer de manière significative Ralentissez. En d'autres termes, c'est le composé le plus retenu dans cet échantillon de mélange. La bande de colorant rouge a une attraction intermédiaire pour la phase mobile et se déplace donc à une intermédiaire vitesse à travers la colonne. Étant donné que chaque bande de colorant se déplace à une vitesse différente, nous sommes en mesure de la séparer par chromatographie.

Figure G : Comprendre le fonctionnement d'une colonne chromatographique - Bandes

Qu'est-ce qu'un détecteur ?
Lorsque les bandes de colorant séparées quittent la colonne, elles passent immédiatement dans le détecteur. Le détecteur contient une cellule à écoulement qui voit [détecte] chaque bande composée séparée sur un fond de phase mobile [voir la figure H]. [En réalité, les solutions de nombreux composés à des concentrations analytiques HPLC typiques sont incolores.] Un détecteur approprié a la capacité de détecter la présence d'un composé et d'envoyer son signal électrique correspondant à une station de données informatique. Un choix est fait parmi de nombreux types de détecteurs différents, en fonction des caractéristiques et des concentrations des composés qui doivent être séparés et analysés, comme indiqué précédemment.

Qu'est-ce qu'un chromatogramme ?
Un chromatogramme est une représentation de la séparation qui s'est produite chimiquement [chromatographiquement] dans le système HPLC. Une série de pics s'élevant à partir d'une ligne de base est tracée sur un axe temporel. Chaque pic représente la réponse du détecteur pour un composé différent. Le chromatogramme est tracé par la station de données informatiques [voir Figure H].

Figure H : Comment les pics sont créés

Sur la figure H, la bande jaune a complètement traversé la cellule d'écoulement du détecteur, le signal électrique généré a été envoyé à la station de données informatique. Le chromatogramme résultant a commencé à apparaître à l'écran. Notez que le chromatogramme commence lorsque l'échantillon a été injecté pour la première fois et commence comme une ligne droite définie près du bas de l'écran. C'est ce qu'on appelle la ligne de base, elle représente la phase mobile pure traversant la cellule d'écoulement au fil du temps. Lorsque la bande jaune de l'analyte traverse la cellule à écoulement, un signal plus fort est envoyé à l'ordinateur. La ligne s'incurve, d'abord vers le haut, puis vers le bas, proportionnellement à la concentration du colorant jaune dans la bande d'échantillon. Cela crée un pic dans le chromatogramme. Une fois que la bande jaune est complètement sortie de la cellule de détection, le niveau du signal revient à la ligne de base, la cellule à écoulement ne contient à nouveau, à nouveau, que de la phase mobile pure. Étant donné que la bande jaune se déplace le plus rapidement, en éluant d'abord de la colonne, c'est le premier pic tracé.

Un peu plus tard, la bande rouge atteint la Flow Cell. Le signal s'élève à partir de la ligne de base lorsque la bande rouge entre d'abord dans la cellule, et le pic représentant la bande rouge commence à être tracé. Dans ce diagramme, la bande rouge n'a pas complètement traversé la Flow Cell. Le diagramme montre à quoi ressembleraient la bande rouge et le pic rouge si nous arrêtions le processus à ce moment-là. Comme la majeure partie de la bande rouge a traversé la cellule, la majeure partie du pic a été dessinée, comme le montre la ligne continue. Si nous pouvions redémarrer, la bande rouge traverserait complètement la Flow Cell et le pic rouge serait terminé [ligne pointillée]. La bande bleue, la plus fortement retenue, se déplace à la vitesse la plus lente et élue après la bande rouge.La ligne pointillée vous montre à quoi ressemblerait le chromatogramme terminé si nous avions laissé l'analyse se poursuivre jusqu'à sa conclusion. Il est intéressant de noter que la largeur du pic bleu sera la plus large car la largeur de la bande bleue de l'analyte, bien que la plus étroite sur la colonne, devient la plus large à mesure qu'elle s'élue de la colonne. En effet, il se déplace plus lentement à travers le lit de matériau de garnissage chromatographique et nécessite plus de temps [et de volume de phase mobile] pour être complètement élué. Étant donné que la phase mobile s'écoule en continu à un débit fixe, cela signifie que la bande bleue s'élargit et est plus diluée. Comme le détecteur répond proportionnellement à la concentration de la bande, le pic bleu est plus faible en hauteur, mais plus large en largeur.


Conclusions et orientations futures

Actuellement, les vaccins à ARNm connaissent un essor dans la recherche fondamentale et clinique. Les 2 dernières années seulement ont vu la publication de dizaines de rapports précliniques et cliniques démontrant l'efficacité de ces plateformes. Alors que la majorité des premiers travaux sur les vaccins à ARNm se concentraient sur les applications contre le cancer, un certain nombre de rapports récents ont démontré la puissance et la polyvalence de l'ARNm pour protéger contre une grande variété d'agents pathogènes infectieux, notamment le virus de la grippe, le virus Ebola, le virus Zika, Streptocoque spp. et T. gondii (Tableaux 1,2).

Alors que les études précliniques ont généré un grand optimisme quant aux perspectives et aux avantages des vaccins à base d'ARNm, deux rapports cliniques récents ont conduit à des attentes plus modérées 22,91. Dans les deux essais, l'immunogénicité était plus modeste chez l'homme que prévu sur la base de modèles animaux, un phénomène également observé avec les vaccins à base d'ADN 171 , et les effets secondaires n'étaient pas négligeables. Nous avertissons que ces essais ne représentent que deux variantes des plates-formes de vaccins à ARNm, et qu'il peut y avoir des différences substantielles lorsque l'expression et les profils immunostimulants du vaccin sont modifiés. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer comment différentes espèces animales répondent aux composants du vaccin à ARNm et aux signaux inflammatoires et quelles voies de signalisation immunitaire sont les plus efficaces chez l'homme.

Les progrès récents dans la compréhension et la réduction de la détection immunitaire innée de l'ARNm ont aidé les efforts non seulement dans la vaccination active mais aussi dans plusieurs applications de l'immunisation passive ou de l'immunothérapie passive pour les maladies infectieuses et le cancer (Encadré 4). Des comparaisons directes entre les plates-formes d'expression d'ARNm devraient clarifier quels systèmes sont les plus appropriés pour l'immunisation passive et active. Compte tenu du grand nombre de plates-formes d'ARNm prometteuses, d'autres comparaisons directes seraient de la plus haute valeur pour le domaine des vaccins, car cela permettrait aux chercheurs de concentrer leurs ressources sur celles qui conviennent le mieux à chaque application.

Le rythme rapide des progrès des vaccins à ARNm n'aurait pas été possible sans les avancées récentes majeures dans les domaines de la détection immunitaire innée de l'ARN et in vivo Modes de livraison. Des recherches fondamentales approfondies sur l'ARN et la biochimie des lipides et des polymères ont permis de traduire les vaccins à ARNm en essais cliniques et ont conduit à un niveau d'investissement étonnant dans les entreprises de vaccins à ARNm (tableau 4). Moderna Therapeutics, fondée en 2010, a levé près de 2 milliards de dollars de capital avec un plan de commercialisation de vaccins et de thérapies à base d'ARNm 172 173 . La US Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA) s'est engagée à soutenir l'évaluation clinique par Moderna d'un vaccin prometteur à ARNm modifié par les nucléosides pour le virus Zika (NCT03014089). En Allemagne, CureVac AG dispose d'un portefeuille en expansion de cibles thérapeutiques 174 , comprenant à la fois le cancer et les maladies infectieuses, et BioNTech développe une approche innovante de la médecine personnalisée contre le cancer à l'aide de vaccins à ARNm 121 (Encadré 2). La traduction de la recherche fondamentale en essais cliniques est également rendue plus rapide par la commercialisation de produits GMP personnalisés par des sociétés telles que New England Biolabs et Aldevron 175 . Enfin, le récent lancement de la Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI) offre un grand optimisme pour les réponses futures aux épidémies virales émergentes. Ce partenariat multinational public et privé vise à lever 1 milliard de dollars pour développer des vaccins basés sur une plate-forme, tels que l'ARNm, afin de contenir rapidement les épidémies émergentes avant qu'elles ne se propagent de manière incontrôlable.

L'avenir des vaccins à ARNm est donc extrêmement prometteur, et les données cliniques et les ressources fournies par ces sociétés et d'autres institutions sont susceptibles de s'appuyer de manière substantielle et de dynamiser la recherche fondamentale sur les thérapies à base d'ARNm.

Encadré 4 : Immunothérapie passive à base d'ARNm

Les anticorps monoclonaux recombinants transforment rapidement le marché pharmaceutique et sont devenus l'une des classes thérapeutiques les plus efficaces pour traiter les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, l'ostéoporose, l'hypercholestérolémie et le cancer 188,189,190,191,192 . Cependant, le coût élevé de la production de protéines et la nécessité d'une administration systémique fréquente constituent une limitation majeure à une accessibilité généralisée. Les technologies de transfert de gènes d'anticorps pourraient potentiellement surmonter ces difficultés, car elles administrent aux patients des séquences nucléotidiques codant pour des anticorps monoclonaux, permettant ainsi in vivo production de protéines thérapeutiques correctement repliées et modifiées 193 . Plusieurs vecteurs de thérapie génique ont été étudiés (par exemple, des vecteurs viraux et de l'ADN plasmidique) qui présentent des limites telles qu'une immunité préexistante de l'hôte, une immunité anti-vecteur acquise, une immunogénicité innée élevée, des difficultés avec in vivo régulation de la production d'anticorps et effets toxiques 193,194 . Les thérapies à base d'ARNm combinent la sécurité avec un contrôle de dose exquis et le potentiel d'administrations multiples sans immunité préexistante ou anti-vecteur. Deux premiers rapports ont démontré que les cellules dendritiques (CD) électroporées avec des ARNm codant pour des anticorps contre des protéines immuno-inhibitrices sécrétaient des anticorps fonctionnels et amélioraient les réponses immunitaires chez les souris 195,196. Trois publications récentes ont décrit l'utilisation d'ARNm injectable pour in vivo production d'anticorps thérapeutiques : Pardi et ses collègues ont démontré qu'une seule injection intraveineuse à des souris d'ARNm modifiés par des nucléosides encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNP) codant pour les chaînes lourdes et légères de l'anticorps neutralisant anti-VIH-1 VRC01 produisait rapidement des niveaux élevés de anticorps dans le sérum et ont protégé des souris humanisées contre l'infection par le VIH-1 197 Stadler et ses collaborateurs ont démontré que l'administration intraveineuse de faibles doses d'ARNm modifiés nucléosidiquement complexés par TransIT (Mirus Bio LLC) codant pour divers anticorps bispécifiques anticancéreux entraînait l'élimination de de grosses tumeurs dans des modèles murins 198 et Thran et ses collègues 199 ont utilisé un système de délivrance d'ARNm-LNP non modifié 12 pour exprimer trois anticorps monoclonaux à des niveaux protégeant des provocations mortelles avec le virus de la rage, la toxine botulinique et une lignée cellulaire de lymphome à cellules B. Aucun effet toxique n'a été observé dans aucune de ces études. Ces observations suggèrent que l'ARNm offre une alternative sûre, simple et efficace à l'administration de protéines d'anticorps monoclonaux thérapeutiques, avec une application potentielle à toute protéine thérapeutique.


Voir la vidéo: 10 Things you Need to Know about Biochromatographuy - FPLC vs HPLC (Janvier 2022).