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Induire l'acquisition de plasmides chez les bactéries pour les rendre sensibles aux antibiotiques


Est-il possible d'utiliser des plasmides pour créer une sensibilité aux antibiotiques chez les bactéries.

Par exemple; in Microbiology, une introduction 13e édition par Pearson , Page 230 « les chercheurs ont retracé le plasmide de résistance aux médicaments à un plasmide trouvé dans E. coli qui résidaient chez les volontaires avant l'étude".

Je me demandais s'il était possible d'induire des plasmides qui rendent ces bactéries sensibles.

Ils doivent être en premier lieu bons pour les bactéries, par exemple une enzyme qui permet aux bactéries d'utiliser un composé. Mais grâce à un antibiotique, cette enzyme catalyserait des composés utiles de la bactérie, faisant de l'antibiotique un cofacteur d'une telle enzyme. Est-il possible? Je le considérais comme un "plasmide de cheval de Troie".

Merci.

Éditer: En lien avec cette question : les plasmides et les mécanismes de conjugaison pourraient-ils être utilisés contre les bactéries résistantes aux antibiotiques ? , il parle de ces plasmides "cheval de Troie" les référant d'une manière qui semble être liée à une fonction bactéricide, si au contraire les plasmides sont liés à un bon taux de survie dans une situation (exemple, 36°C) mais à un bactériostatique situation (la température monte jusqu'à 39°) ou comme l'hémoglobine fonctionne avec le CO, c'est fondamental pour nous mais la sélection n'a pas fonctionné pour résoudre ce problème et se lie toujours à la molécule.

Ce type de coévolution dans Wolbachia https://en.m.wikipedia.org/wiki/Wolbachia rend l'insecte hôte susceptible d'avoir besoin de la bactérie pour la reproduction, bien qu'il soit bon dans certaines conditions environnementales, il induit l'infertilité dans d'autres.

Ou en induisant des variantes de gènes qui sont toujours fonctionnelles mais partagées dans certaines conditions, si ces conditions ne sont pas présentes dans l'environnement, la variante du gène pourrait se propager sans causer de problèmes de compétition avec la variante d'origine jusqu'à ce que ces conditions environnementales soient remplies pour atteindre un équilibre dans laquelle un % de la population pourrait être utilisé comme cible de cet antibiotique.


Mécanismes de résistance bactérienne aux antibiotiques

Les trois mécanismes fondamentaux de la résistance aux antimicrobiens sont (1) la dégradation enzymatique des médicaments antibactériens, (2) l'altération des protéines bactériennes qui sont des cibles antimicrobiennes et (3) les modifications de la perméabilité membranaire aux antibiotiques. La résistance aux antibiotiques peut être soit à médiation plasmidique, soit maintenue sur le chromosome bactérien. Le mécanisme de résistance aux pénicillines et aux céphalosporines le plus important est l'hydrolyse des antibiotiques médiée par l'enzyme bactérienne bêta-lactamase. L'expression de la bêta-lactamase chromosomique peut être induite ou diminuée de manière stable par l'exposition aux bêta-lactamines. Les méthodes pour surmonter la résistance aux antibiotiques bêta-lactames comprennent le développement de nouveaux antibiotiques qui sont stables à l'attaque des bêta-lactamases et la co-administration d'inhibiteurs de bêta-lactamases avec des médicaments bêta-lactames. La résistance à la méthicilline, qui est stable à la bêta-lactamase à Gram positif, se produit par l'altération d'une protéine cible antibiotique, la protéine de liaison à la pénicilline 2. La production d'enzymes modifiant les antibiotiques et la synthèse de cibles bactériennes insensibles aux antibiotiques sont les principaux mécanismes de résistance. pour les autres classes d'antibiotiques, y compris le triméthoprime, les sulfamides, les aminosides, le chloramphénicol et les quinolones. La pénétration réduite des antibiotiques est également un mécanisme de résistance pour plusieurs classes d'antibiotiques, y compris les bêta-lactamines, les aminosides, le chloramphénicol et les quinolones.


Les principales porines OmpK35 et OmpK36 de Klebsiella pneumoniae permettent une diffusion plus efficace des -lactames que leurs homologues d'Escherichia coli OmpF et OmpC

Klebsiella pneumoniae, l'un des pathogènes nosocomiaux les plus importants, devient un problème majeur dans les soins de santé en raison de sa résistance à de multiples antibiotiques, dont les céphalosporines de dernière génération et, plus récemment, même les carbapénèmes. Ceci est largement dû à la propagation des β-lactamases à spectre étendu codées par des plasmides. Cependant, les agents antimicrobiens doivent d'abord pénétrer la barrière membranaire externe afin d'atteindre leurs cibles, et les -lactames hydrophiles et chargés diffusent vraisemblablement à travers les canaux de porine. Malheureusement, les propriétés des canaux poriniques de K. pneumoniae sont largement inconnues. Dans cette étude, nous avons effectué des suppressions nettes des gènes de porine de K. pneumoniae ompK35 et ompK36 et examiné les sensibilités aux antibiotiques et les taux de diffusion des -lactamines. Les résultats ont montré que OmpK35 et OmpK36 produisaient des canaux plus perméables que leurs homologues d'Escherichia coli OmpF et OmpC OmpK35 produisait en particulier un canal de diffusion d'une perméabilité remarquablement élevée vers les composés lipophiles (benzylpénicilline) et grands (céfépime). Ces résultats ont également été confirmés en exprimant diverses porines dans une souche d'E. coli dépourvue de porines majeures et de la pompe d'efflux multimédicament majeure AcrAB. Nos données expliquent pourquoi le développement de la résistance aux médicaments chez K. pneumoniae s'accompagne si souvent de la perte mutationnelle de ses porines, en particulier OmpK35, en plus des divers gènes plasmidiques de résistance aux antibiotiques, car même l'hydrolyse par les -lactamases devient inefficace. à produire des niveaux élevés de résistance si la bactérie continue à permettre un afflux rapide de -lactames à travers ses larges canaux de porine.

Importance: Chez les bactéries à Gram négatif, les médicaments doivent d'abord pénétrer dans la membrane externe, généralement par les canaux poriques. Ainsi, l'examen quantitatif des taux d'afflux est essentiel pour l'évaluation des mécanismes de résistance, mais aucune étude de ce type n'existe pour un agent pathogène nosocomial très important, Klebsiella pneumoniae. son homologue Escherichia coli, OmpF. Cela rend les souches de K. pneumoniae non modifiées plus sensibles aux antibiotiques relativement importants, tels que les céphalosporines de troisième et quatrième générations. De plus, même l'acquisition de puissantes β-lactamases n'est pas susceptible de les rendre totalement résistantes en présence d'un processus d'afflux aussi efficace, ce qui explique pourquoi tant d'isolats cliniques de cet organisme manquent de porines.

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Les figures

SDS-PAGE de la membrane externe…

SDS-PAGE des protéines membranaires externes de K. pneumoniae ATCC 11296 et ses…


INFECTIONS BACTÉRIENNES RÉSISTANT AUX ANTIBIOTIQUES

Les infections résistantes aux antibiotiques sont déjà répandues aux États-Unis et dans le monde entier. 1 Une enquête nationale de 2011 auprès de spécialistes des maladies infectieuses, menée par le réseau IDSA Emerging Infections Network, a révélé que plus de 60 % des participants avaient vu une infection bactérienne pan-résistante et incurable au cours de l'année précédente. 7 De nombreux organismes de santé publique ont décrit l'émergence rapide de bactéries résistantes comme un « scénario de crise ou de cauchemar » qui pourrait avoir des conséquences « catastrophiques ». 8 Le CDC a déclaré en 2013 que la race humaine est désormais à l'ère post-antibiotique, et en 2014, l'Organisation mondiale de la santé (OMS) a averti que la crise de la résistance aux antibiotiques devenait grave. 15 bactéries MDR ont été déclarées une menace importante pour la santé publique et la sécurité nationale des États-Unis par l'IDSA et l'Institute of Medicine, ainsi que par le groupe de travail fédéral interagences sur la résistance aux antimicrobiens. 1

Parmi les pathogènes à Gram positif, une pandémie mondiale de résistance S. aureus et les espèces Enterococcus constituent actuellement la plus grande menace. 5 , 16 Le SARM tue plus d'Américains chaque année que le VIH/SIDA, la maladie de Parkinson, l'emphysème et les homicides réunis. 1, 12 Les entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) et un nombre croissant d'autres agents pathogènes développent une résistance à de nombreux antibiotiques courants. 1 La propagation mondiale de la résistance aux médicaments parmi les agents pathogènes respiratoires courants, y compris Streptococcus pneumoniae et Mycobacterium tuberculosis, est épidémique. 16

Les agents pathogènes à Gram négatif sont particulièrement inquiétants car ils deviennent résistants à presque toutes les options d'antibiotiques disponibles, créant des situations qui rappellent l'ère pré-antibiotique. 1 , 5 , 16 L'émergence des bacilles gram-négatifs MDR (et de plus en plus pan-résistants) a affecté la pratique dans tous les domaines de la médecine. 1 Les infections à Gram négatif les plus graves surviennent dans les établissements de santé et sont le plus souvent causées par des entérobactéries (principalement Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa, et Acinetobacter. 5 , 16 Les agents pathogènes gram-négatifs MDR sont également de plus en plus répandus dans la communauté. 16 Il s'agit notamment de la production de bêta-lactamases à spectre étendu Escherichia coli et Neisseria gonorrhoeae. 16


L'un des mécanismes par lesquels certaines bactéries deviennent résistantes aux antibiotiques est la dégradation ou l'inactivation des médicaments. Ce faisant, ils rendent les médicaments inefficaces, ce qui leur permet de continuer à proliférer.

Ici, l'un des meilleurs exemples est la capacité de certaines bactéries à résister aux effets des antibiotiques bêta-lactamines grâce à la production d'enzymes bêta-lactamases.

Pour de nombreuses bactéries, la paroi cellulaire, constituée de peptidoglycane, est un élément important qui non seulement renforce la cellule, mais maintient également la forme de la cellule et empêche également la cellule d'éclater en raison de la pression osmotique.

Le peptidoglycane, qui est un composant principal de la paroi cellulaire, est composé de N-acétylglucosamine, d'acide N-acétyl muramique ainsi que de chaînes de réticulation d'acides aminés. Des enzymes connues sous le nom de protéines de liaison à la pénicilline (transpeptidase et D-alanyl carboxypeptidase) sont impliquées dans la réticulation lors de l'assemblage des couches de peptidoglycane dans la paroi cellulaire.

Les antibiotiques bêta-lactamines, qui comprennent la pénicilline et les céphalosporines (qui ont un cycle bêta-lactamine) fonctionnent en ciblant les deux enzymes et inhibent ainsi la synthèse de la paroi cellulaire. Ce faisant, ils endommagent la paroi cellulaire et entraînent la destruction de la cellule en raison de la pression osmotique interne élevée. la cellule éclate parce que la construction de la paroi cellulaire est affectée.

Pour les bactéries capables de produire de la bêta-lactamase (de celles qui acquièrent la capacité de le faire), elles sont capables de désactiver le médicament en brisant le cycle bêta-lactame, désactivant ainsi l'antibiotique par un processus appelé hydrolyse.

* Chez les bactéries à Gram positif, la production d'enzyme bêta-lactamase est induite par la présence de l'antibiotique (antibiotique bêta-lactame). Cependant, l'enzyme est continuellement produite par des bactéries à Gram négatif même dans les cas où la bactérie n'a pas été exposée à l'antibiotique.

Certaines des bactéries qui produisent l'enzyme bêta-lactamase comprennent :

    aureus
  • Neisseria gonorrhoeae
  • Bacilles anaérobies à Gram négatif
  • Haemophilus influenzae
  • E. coli

Transposons

Les transposons de résistance sont essentiellement des systèmes de gènes sauteurs qui incorporent un gène de résistance dans l'élément. Ils se présentent sous de nombreuses formes, se distinguant par leur structure, leur parenté génétique et leur mécanisme de transposition et peuvent porter une variété de gènes de résistance (Bennett, 2005). Ce qui est illustré ( Tableaux 1 et ​ et 2) 2 ) ne sont que quelques-uns de ceux connus. Tous ces éléments ont la capacité de se déplacer à la fois intra- et inter-moléculaire, c'est-à-dire qu'ils peuvent sauter d'un site à un autre au sein d'une molécule d'ADN ou d'une molécule d'ADN à une autre, par exemple d'un plasmide à un autre, ou d'un plasmide à un chromosome bactérien et vice versa. Ces mécanismes ne nécessitent généralement pas d'homologie d'ADN entre l'élément et les sites d'insertion et bien qu'il existe des exemples où un transposon particulier a une forte préférence pour une séquence nucléotidique particulière à un site d'insertion, de nombreux autres ne montrent aucune préférence évidente et s'insèrent dans de nouveaux sites plus ou moins au hasard (Craig, 1997).

Tableau 1

TransposonTaille (ko)Éléments terminauxMarqueurs)
Éléments à Gram négatif
 Tn55.7EST50 (RI)KmBlSm
 Tn92.5EST1 (RD)Cm
 Tn109.3EST10 (RI)Tc
 Tn9033.1EST903 (RI)Km
 Tn15254.4EST15 (RD)Km
 Tn235010.4EST1 (RD)Km
    
Éléments à Gram positif
 Tn40014.7EST256 (RI)GmTbKm
 Tn40033.6EST257 (RD)Tm

Phénotypes de résistance : Bl, bléomycine Cm, chloramphénicol Gm, gentamicine Km, kanamycine Sm, streptomycine Tb, tobramycine Tc, tétracycline Tm, triméthoprime.

Abréviations : pb, paire de bases DR, répétition directe IR, répétition inversée kb, kilobase.

Tableau 2

TransposonTaille (ko)IR terminaux (pb)Marqueurs)
Éléments à Gram négatif
 Tn1538/38Ap
 Tn3538/38Ap
 Tn212035/38SmSuHg
 Tn5018.235/38Hg
 Tn172111.435/38Tc
 Tn39267.836/38Hg
    
Éléments à Gram positif
 Tn5515.335Éry
 Tn9175.338Éry
 Tn44516.212Cm

Phénotypes de résistance : Ap, ampicilline Cm, chloramphénicol Ery, érythromycine Hg, ions mercuriques Sm, streptomycine Su, sulfamide Tc, tétracycline.

Abréviations : pb, paire de bases IR, répétition inversée kb, kilobase.

Les transposons appartiennent à l'ensemble des éléments mobiles appelés éléments transposables qui englobe de petits éléments cryptiques appelés séquences d'insertion (éléments IS), des transposons et des bactériophages transposables, tels que le bactériophage μ (Bennett, 2004). Ce dernier type d'élément est un virus bactérien qui utilise la transposition pour se répliquer. Un transposon diffère d'un élément IS en ce qu'il code au moins une fonction qui modifie le phénotype de la cellule de manière prévisible, par exemple un transposon de résistance confère une résistance à un ou plusieurs antibiotiques particuliers.

Les transposons sont soit des systèmes modulaires, appelés transposons composites, construits à partir d'une paire d'éléments IS et d'une séquence d'ADN centrale qui n'est pas intrinsèquement capable de transposer, dont l'expression modifie le phénotype cellulaire (Figures 2 et ​ et3) 3 ) ou des systèmes complexes où les fonctions de transposition et de non-transposition n'ont manifestement pas été assemblées de façon modulaire ( figure 4 ). Pour un transposon de résistance dépendant de l'élément IS, deux copies du même élément IS sont nécessaires en tant que structures terminales flanquantes, sous forme de répétitions directes ou inversées, dans la section centrale qui contient le ou les gènes qui confèrent la résistance aux antibiotiques. Bien que l'arrangement inversé des éléments IS soit génétiquement plus stable, l'arrangement répété direct offre des opportunités de migrer vers un autre site où l'élément IS se trouve également. Cela se produit par un processus de recombinaison homologue en deux étapes par lequel une partie de la structure composite est d'abord excisée de son site existant par un seul croisement entre les copies de l'élément IS libérant une espèce d'ADN circulaire à double brin comprenant la section centrale du composite. transposon de résistance et une copie de l'élément IS, l'autre restant à l'emplacement génétique d'origine. L'ADN libéré peut alors être récupéré, essentiellement en inversant la première recombinaison, par recombinaison homologue impliquant un seul croisement, en utilisant la copie de la séquence IS sur l'intermédiaire libre et une autre copie au nouvel emplacement, qui recrée le transposon composite au nouveau placer. Comme les éléments IS peuvent généralement être trouvés sur de nombreux sites différents, en particulier sur différents plasmides, le potentiel de déplacement des gènes de résistance par cette méthode est considérable. En conséquence, il y a des avantages et des inconvénients concernant les deux arrangements. Les modules de transposition, les éléments IS, conservent généralement la capacité de transposer en tant qu'éléments individuels ainsi qu'en tant que partie de la structure composée. Ce n'est pas le cas des éléments complexes, indivisibles quant à la transposition. Les transposons bien connus Tn5, codant pour la résistance aux aminosides tels que la kanamycine et la néomycine, et Tn10 codant pour la résistance à la tétracycline, sont des éléments composés trouvés dans un certain nombre de bactéries Gram-négatives, en particulier les membres des entérobactéries. De telles structures composées sont créées par hasard et s'établissent dans une population de cellules par les forces sélectives agissant sur la flore bactérienne, par exemple l'exposition à la kanamycine/néomycine ou à la tétracycline, respectivement, lorsque l'élément particulier confère un avantage de survie distinct. Avec le temps, la structure a tendance à subir des changements qui la stabilisent. Beaucoup de ces éléments peuvent avoir une genèse relativement récente. En revanche, Tn3, codant pour la résistance à un certain nombre d'antibiotiques β-lactame, y compris l'ampicilline, et Tn21 (Figure 5), codant pour la résistance à la streptomycine, à la spectinomycine et aux sulfamides ainsi qu'aux ions mercuriques, sont des exemples de transposons complexes et sont également couramment trouvés sur les plasmides chez les membres des entérobactéries. La construction de ce type d'élément est moins facile à expliquer et aucun modèle général fondé sur des preuves n'a encore été proposé, bien que les aspects de la construction de certains transposons complexes, tels que Tn21, peut être déduit. Tn3, Tn21 et les éléments similaires sont susceptibles d'être un peu plus anciens que la plupart des transposons composites et sont probablement le résultat d'événements de recombinaison multiples, comprenant à la fois des insertions et des suppressions, qui insèrent d'abord des fonctions de non-transposition dans un élément cryptique, puis affinent la séquence par suppression pour éliminer les fonctions « non essentielles ». Ce raffinement rendrait l'élément plus compact et donc plus facilement transposable. Il a été démontré que l'augmentation de la taille d'un élément transposable particulier réduit sa fréquence de transposition.

Une représentation schématique du transposon de résistance composite Tn5 qui confère une résistance à la kanamycine, à la bléomycine et à la streptomycine. O, I, limites extérieures et intérieures du terminal IS inversé50 éléments accueillant les répétitions inversées (IR) terminales courtes qui définissent IS50L (copie de gauche de IS50) et est50R (copie de droite de IS50) et qui sont indispensables à la transposition des deux SI50 et Tn5 km, gène de résistance à la kanamycine bl, gène de résistance à la bléomycine sm, gène de résistance à la streptomycine tnp, gène codant pour l'IS50 transposer inh, gène codant pour un inhibiteur de l'IS50 transposase pb, paires de bases (pour plus d'informations, voir Reznikoff, 2002).

Une représentation schématique du transposon de résistance composite Tn10 qui confère une résistance aux tétracyclines. Tn10 affiche les répétitions inversées terminales de IS10 EST10L, copie de gauche de IS10, une copie non fonctionnelle d'IS10 due à de multiples mutations dans le gène de la transposase IS10R, copie de droite de IS10 qui code pour une transposase fonctionnelle et une molécule d'ARN antisens utilisée pour réguler à la baisse l'expression du gène de la transposase IR, de courtes séquences répétées inversées trouvées aux extrémités de l'IS10, qui sont indispensables à la transposition des deux SI50 et Tn10 tetA, gène codant pour la pompe d'efflux de résistance à la tétracycline tetC,D, gènes co-régulés avec tetUNE tetR, gène codant pour un répresseur transcriptionnel nécessaire à l'expression inductible, par la tétracycline, de la pompe d'efflux de tétracycline TetA pb, paires de bases (pour plus d'informations voir Haniford, 2002).

Une représentation schématique du transposon de résistance complexe Tn3 qui confère une résistance à l'ampicilline et à certains autres antibiotiques β-lactame. IR, les courtes séquences inversées répétées trouvées aux extrémités du transposon, qui sont essentielles pour Tn3 transposition tnpA, transposase de l'élément codant pour le gène tnpR, gène codant pour une recombinase spécifique au site qui résout la structure de cointégration de transposition générée par la transposition blaTEM-1, gène codant pour la TEM-1 β-lactamase pb, paires de bases kb, kilobase.

Une représentation schématique du transposon de résistance complexe Tn21 qui confère une résistance à la streptomycine, à la spectinomycine, aux sulfamides et aux ions mercuriques. merTPCAD, gènes codant pour la résistance aux ions mercuriques et à certains composés organo-mercuriels merR, gène codant pour le répresseur transcriptionnel de l'opéron mer inductible sul1, gène codant pour la résistance aux sulfamides annonceA1, gène codant pour la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine entier, gène de l'intégrase attI, site d'insertion de la cassette du gène de l'intégron tnpA, gène codant pour le Tn21 transposer tnpR, gène codant pour une recombinase site-spécifique responsable de la résolution de la structure de cointégration de transposition générée par la transposition pentier, entier promoteur pc, promoteur de cassettes de gènes d'intégrons et sul1.


DISCUSSION

Outils pour in situ la manipulation du microbiote n'en sont qu'à leurs balbutiements. Ici, nous démontrons la capacité de la stratégie antibactérienne TAP à exercer une activité antibactérienne efficace et spécifique à la souche au sein de populations multi-espèces in vitro. L'activité de destruction sélective des TAP induit une perte de viabilité 4-log de l'espèce testée. Les TAP ciblant les plasmides de résistance aux carbapénèmes pOXA-48a entraînent une augmentation de 4 à 5 logs de la sensibilité de la souche au médicament. La plupart des méthodologies d'administration CRISPR actuellement en cours de développement se concentrent sur l'utilisation de bactériophages, qui ont une gamme d'hôtes intrinsèquement étroite (35, 36, 7). En outre, plusieurs études récentes utilisent avec succès les systèmes de conjugaison RK2 à large gamme d'hôtes pour fournir un système CRISPR qui cible E. coli ( 7-9, 37) ou S. enterica ( 11) in vitro. Un avantage clé de notre stratégie par rapport à ces approches est la polyvalence conférée par l'algorithme du CSTB qui permet l'identification robuste de l'ARNg qui devrait être utilisé pour recibler spécifiquement les TAP contre une ou plusieurs souches bactériennes d'intérêt, sans cibler d'autres espèces. Malgré la disponibilité de nombreux programmes dédiés à l'identification des motifs CRISPR, le CSTB n'a pas d'équivalent à ce jour (34). Un autre avantage est la conception modulaire et la taille relativement petite des TAP mobilisables (par rapport aux plasmides de conjugaison autonomes) qui sont facilement modifiables. La séquence espaceur qui dirige le TAP contre la ou les souches ciblées, ainsi que les autres biobriques constitutives (origine de réplication, origine de transfert, Cas9, gène de résistance) peuvent être modifiées en une seule étape de clonage (voir méthodes), permettant ainsi la construction rapide d'une bibliothèque de TAP adaptée aux applications envisagées. Enfin, l'expression constitutive du système CRISPR (et des reporters fluorescents) à partir de promoteurs actifs dans une large gamme d'entérobactéries évite la nécessité d'un inducteur externe, rendant l'approche TAP plus adaptée à la modification des communautés bactériennes naturelles in vivo.

Les TAP conçus pour induire des cassures double brin (DSB) médiées par Cas9 sur le chromosome de la bactérie ciblée déclenchent une perte de viabilité significative. Cependant, nous observons l'émergence de bactéries ciblées qui ont développé des mutations leur permettant de survivre malgré l'acquisition du TAP. La fréquence de ces mutants TAP-escape varie de ∼3 × 10 -4 à 6 × 10 -5 selon l'espaceur et les souches receveuses utilisées (Figures 1D, 3A, 4B et 5B). L'analyse phénotypique et séquentielle de E. coli et C. rodentium les mutants d'échappement révèlent deux mécanismes principaux pour échapper à l'activité TAP : (i) Le premier mécanisme est l'acquisition d'insertions (transposase ou séquences d'insertion, IS) ou de délétions de nucléotides uniques qui inactivent le cas9 gène porté par le TAP. Ces types de mutations permettant aux bactéries d'échapper à l'activité CRISPR ont déjà été signalés comme se produisant avec une fréquence comparable (7, 38, 39, 11). Il a également été rapporté que des mutations ou des délétions dans les séquences de tracrRNA ou de crRNA sont un autre moyen d'inactiver les systèmes CRISPR (7, 40, 39, 38). Pourtant, aucune mutation de ce type n'a été trouvée dans le C. rodentium ni E. coli Mutants TAP-escape analysés, potentiellement en raison de leur moindre fréquence d'occurrence. (ii) Le deuxième mécanisme que nous avons identifié est l'acquisition de mutations ponctuelles ou de délétions qui modifient le locus ciblé, empêchant ainsi la reconnaissance par l'ARNg. Ceux-ci ont également été décrits précédemment (15, 28, 11, 38, 7). Lors de l'utilisation de TAP qui ciblent un locus chromosomique dans E. coli et C. rodentium, les mutations d'échappement se produisent par cas9-inactivation (premier mécanisme) dans 38,7 et 42,8%, et par modification du locus ciblé (deuxième mécanisme) dans 61,3% et 57,2%, de manière correspondante.

Nous montrons que la contribution des mutations d'échappement par modification de la séquence chromosomique peut être considérablement, sinon complètement réduite en dirigeant les TAP contre plusieurs loci chromosomiques. En effet, la probabilité de muter plusieurs sites chromosomiques au sein d'une même cellule bactérienne devrait diminuer à mesure que le nombre de sites ciblés augmente. Lors de l'utilisation de l'entretoise Cr22 qui cible 22 loci de C. rodentium chromosome, tous les dix-neuf mutants d'échappement testés portent des mutations qui inactivent le TAP-né cas9 gène. Par conséquent, nous observons une diminution de 2,9 fois de la fréquence des échappés TAP-Cas9-Cr22 (8,56 × 10 −5 ) par rapport à TAP-Cas9-Cr1 (2,47 × 10 −4 ) qui cible un seul locus chromosomique. Cette diminution est cohérente avec nos estimations des contributions relatives de chaque mécanisme d'échappement.

La fréquence observée des mutations d'échappement par cas9 l'inactivation est probablement liée au taux intrinsèque de transposition estimé osciller entre 10 -5 et 10 -6 dans E. coli (41) et le taux de mutations spontanées (10 -8 et 10 -10 par paire de bases et génération). Dans le cas des TAP, il est également possible que l'induction de DSB entraîne une augmentation des taux de mutation par le déclenchement du phénotype hypermutateur induit par SOS. Cui et Bikard ont démontré qu'un moyen d'améliorer l'efficacité de CRISPR dans E. coli cellule hôte doit inhiber l'activité RecA, qui est essentielle à la réparation des DSB et à l'induction de la réponse SOS (15). Moréb et al. a en outre proposé d'inhiber l'activité RecA en co-exprimant le système CRISPR avec un allèle négatif dominant de la recA gène (42). Ces stratégies sont cependant moins pertinentes dans le cas de l'approche TAP, car elles altéreraient probablement la capacité de recombinaison et donc la viabilité de la population non ciblée.

Nous avons également abordé la possibilité qu'une partie des mutations des TAP émergent déjà dans les cellules donneuses, entraînant ainsi le transfert de TAP déjà inactifs dans la cible receveuse. Cette possibilité est étayée par l'analyse de séquençage d'un C. rodentium mutant d'échappement qui a reçu TAP-Cas9-Cr1 d'un E. coli donneur. Le séquençage a révélé l'insertion dans cas9 de insAB gènes codant pour les éléments de transposase présents dans E. coli mais absent de C. rodentium génomes. Ce résultat indique qu'une mutation conduisant à l'inactivation des TAP peut se produire dans les cellules donneuses avant le transfert, sans exclure qu'elles puissent également émerger chez le receveur ciblé après l'acquisition du plasmide.

Notre travail révèle que l'efficacité des TAP est principalement déterminée par deux principaux facteurs limitatifs. Le premier facteur limitant est la fréquence ∼10 −4 –10 −5 des clones échappés qui acquièrent des mutations inactivant le plasmide né cas9 gène, ou des mutations qui modifient la séquence ciblée. L'occurrence de clones échappés due à l'acquisition de TAP qui ont été inactivés avant le transfert pourrait être réduite en utilisant un transposon-free E. coli souche donneuse (43). Comme représenté sur la C. rodentium, l'émergence de clones échappés par mutation de la séquence ciblée peut être évitée en ciblant plusieurs sites sur le génome. Alternativement, il a été montré qu'un autre moyen d'éviter l'émergence de mutants d'échappement par la modification du chromosome est de cibler des gènes essentiels, dont la mutation est souvent mortelle pour la cellule (40). Le deuxième paramètre limitant est l'efficacité du transfert des TAP vers la ou les souches ciblées. Cette efficacité dépend principalement du système de conjugaison choisi pour mobiliser les TAP. Ici, nous utilisons le plasmide F comme un plasmide auxiliaire qui médie un transfert de TAP relativement efficace (10 -1 -10 -2 ) vers des entérobactéries étroitement apparentées. Par conséquent, les TAP semblent appropriés pour cibler une gamme de bactéries à Gram négatif pathogènes ou résistantes cliniquement pertinentes (E. coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Salmonelle, Yersinia, Shigella, Serratia,etc.). Récemment, le plasmide pPD1 à gamme d'hôtes étroite a également été utilisé pour transférer les systèmes CRISPR/Cas vers le système Gram-positif. Enterococcus faecalis (44). D'autres méthodologies antibactériennes (7, 11) ou anti-drogue (8-10) utilisant la conjugaison sont principalement basées sur le système de conjugaison incP RK2, qui offre une large gamme d'hôtes, mais une faible efficacité de transfert (10 -4 -10 -5 ). Hamilton et al. ont montré que l'efficacité de transfert peut être augmentée artificiellement en utilisant des billes de verre in vitro (11). Il est également possible d'isoler des systèmes de conjugaison à large gamme d'hôtes avec une transférabilité accrue. De tels mutants plasmidiques super-épandeurs ont été isolés avec succès par l'approche Tn-seq (45, 46) et pourraient représenter une option intéressante pour élargir la gamme de bactéries vers lesquelles les TAP pourraient être efficacement transférés.

Traduire le présent in vitro preuve de concept à in situ constituerait une étape importante vers l'élaboration d'une stratégie non antibiotique pour le in situ manipulation de la composition du microbiote, de manière dirigée. L'efficacité de la méthodologie TAPs au sein des communautés bactériennes associées à l'hôte dépendrait principalement des taux de conjugaison in situ, qui diffère souvent des taux atteints in vitro ( 47). Par exemple, il a été récemment rapporté que le plasmide IncI2 TP114 et les plasmides de type IncX sont très activement transférés dans le tractus intestinal de la souris (47) et dans les microbiomes fécaux humains (48), respectivement, ce qui en fait de bons candidats pour mobiliser les TAP dans ces écosystèmes donnés. . Les TAP pourraient être utilisés pour l'inhibition de souches pathogènes et de résistance nuisibles provenant d'un hôte ou d'environnements infectés, ou comme stratégie anti-virulence par l'inhibition de gènes effecteurs de virulence ou de gènes impliqués dans la formation de biofilm. La future mise en œuvre de l'approche PAT dans des contextes cliniques ou environnementaux nécessiterait la prise en compte des réglementations en évolution rapide sur les OGM, le CRISPR et le bioconfinement (49-51).


Points forts

La résistance aux antibiotiques (RA) chez les bactéries est l'une des plus grandes menaces auxquelles l'humanité est actuellement confrontée, et les plasmides jouent un rôle essentiel dans la dissémination de la RA parmi les agents pathogènes cliniquement importants.

Certaines associations entre les plasmides AR et les clones bactériens pathogènes sont extrêmement répandues.

En l'absence de sélection pour les caractères codés par des plasmides, la plupart des plasmides réduisent la valeur adaptative bactérienne. Récent in vitro les résultats montrent que ce coût est atténué par une évolution compensatoire. Ces dynamiques évolutives (coût versus compensation) déterminent le sort du clone porteur de plasmide dans la population bactérienne.

L'implication des coûts plasmidiques et de l'évolution compensatoire dans l'augmentation et la propagation des associations plasmide-bactérie réussies dans des contextes cliniques reste inexplorée.

Les infections résistantes aux antibiotiques sont un problème urgent en milieu clinique car elles augmentent fortement le risque de mortalité chez les patients gravement malades. La propagation horizontale des gènes de résistance aux antibiotiques parmi les bactéries est entraînée par les plasmides bactériens, favorisant l'évolution de la résistance. Fondamentalement, des associations particulières existent entre les plasmides de résistance et les clones bactériens qui deviennent particulièrement efficaces en milieu clinique. Cependant, les facteurs qui sous-tendent le succès de ces associations restent inconnus. Récent in vitro les preuves révèlent (i) que les plasmides produisent des coûts de fitness chez les bactéries, et (ii) que ces coûts sont atténués au fil du temps grâce à des mutations compensatoires. Je soutiens que les coûts imposés par les plasmides et l'adaptation compensatoire subséquente peuvent déterminer le succès des associations entre les plasmides et les bactéries en milieu clinique, façonnant le in vivo évolution de la résistance aux antibiotiques.


Un facteur de virulence bactérien deux pour un révélé

L'arc-en-ciel de couleurs est créé par différentes concentrations de sidérophores, des molécules sécrétées par des bactéries pour voler le fer d'un hôte lors d'une infection. Credit: Shangwen Luo/ University of Illinois at Chicago

We've all seen the headlines. "Man found to be shedding virulent strain of polio" "Virulent flu strain in Europe hits the economy" "Most virulent strain of E. coli ever seen contains DNA sequences from plague bacteria."

To most of us "virulent" means "aggressive," or just plain "bad," but to a microbiologist it has a more specific meaning. Virulent strains of bacteria are ones that produce "virulence factors," small molecules and proteins that convert a benign bacterium into a pathogen.

They make the difference between E. coli that are helpful members of our gut microbiome and the E. coli O157:H7 responsible for the Jack-in-the-Box outbreak.

Virulence factors allow bacteria to evade the human immune system, to infect tissues and cells and to establish a foothold within the body. Without them, bacteria would be rapidly cleared by the immune system and unable to establish an infection.

Tim Wencewicz, PhD, assistant professor of chemistry in Arts & Sciences at Washington University in St. Louis, thinks we should be looking for agents that block virulence factors rather than continuing to search for ones to kill bacteria outright. In his vision, antivirulence antibiotics would replace failing bactericidal ones.

"Do we have to find molecules that kill bacteria to fight bacterial infections?," he asks. "Is that really what we have to do?"

The siderophore actinobactin secreted by the bacterium A. baumannii clutching an iron atom (orange) it has stolen from the host for the bacterium's benefit. Credit: Tim Wencewicz

Traditional antibiotics carry with them the seeds of their own destruction, he said. The megadoses of broad spectrum antibiotics often given to patients in clinical medicine apply tremendous selective pressure to bacterial communities, creating rich opportunities for resistant strains by eliminating all susceptible ones.

"Antivirulence antibiotics would apply much less selective pressure," Wencewicz said. "If you treat bacteria in a test tube with an antivirulence antibiotic, the bacteria will grow as if there is no antibiotic there. But if you treat bacteria in the human body, bacterial growth will be suppressed. The antivirulence antibiotic behaves like a traditional bacteriostatic antibiotic, suppressing pathogen's growth until the immune system has time to recognize and clear it.

"We could give anti-virulence antibiotics to people with healthy immune systems, who would be able to clear infections with this assistance," he said, "and traditional antibiotics combined with antivirulence therapies to people with compromised immune systems, who really need them."

In the online issue of the February issue of the ACS journal Maladies infectieuses, Wencewicz describes one possible drug target: an iron-seeking molecule secreted by the bacterium Acinetobacter baumannii. Now that the complex biochemistry of this virulence factor is better understood, he plans to start looking for agents that block its synthesis or activity.

The bacterium Wencewicz studied illustrates how quickly and spectacularly traditional antibiotics can fail.

A. baumannii, sometimes called "Iraqibacter," emerged as a battlefield pathogen during the wars in the Middle East. "People would be injured, go to the hospital with an open wound and get an Actinetobacter infection," Wencewicz said. "Doctors tried to treat these infections with every drug at their disposal and they found that they were resistant to almost every FDA approved antibiotic. Nothing worked against these infections."

The resistant bacteria soon spread globally and leaked out of hospitals into communities.

A. baumannii is a bad pathogen not because of the number of infections it causes— Staphylococcus aureus causes many more—but because its hallmark is multi-drug resistance.

A Gram-negative bacterium, it has a double cell wall and so is intrinsically resistant to most classes of antibiotics. "Just the fact that it is Gram-negative tosses off the table many antibiotics that would work against Staph, which is Gram-positive," Wencewicz said.

"So you start with a smaller set of antibiotics, but A. baumannii are often resistant to those as well because they swap resistance genes," Wencewicz said. A strain that caused an outbreak in China in 2008 carried a "massive" plasmid, or mobile DNA element, that included 45 resistance genes, he said.

As the pH of its surroundings rises, the siderophore pre-actinobactin (top) rearranges itself structurally to form the molecule actinobactin (bottom) that functions better at the new pH. Two copies of the molecules join to grasp an iron atom. Credit: Tim Wencewicz

If a patient has resistant A. baumannii, the standard of care is to drop back to polymixins, compounds developed in the 1950s that were abandoned in the 1950s because they are so toxic to kidneys, he said. Now, strains resistant to polymixins are being found in hospitals.

"Given the speed with which pathogens resistant to bactericidal antibiotics took over when we selected for them with broad spectrum antibiotics, we should design the next generation of drugs with bacterial evolution in mind," he said.

One class of virulence factors common to many pathogens is siderophores, small molecules whose job is to seek out iron in the environment, wrap around it, and bring it back to the bacterial cell.

"When you get an infection, your body's first response is to starve out the invader. You hide all your nutrients: you flush your amino acids into your kidneys, and drain all nutrient supplies in the blood," Wencewicz said.

This is a particularly effective strategy in the case of iron, because iron is in short supply to begin with. The concentration of iron in the blood can be 10-24 molar (one yoctomole or about one atom of iron per 1.6 liters of blood). Living things need about 10-6 molar concentrations of iron (micromoles) to survive, Wencewicz said.

"Bacteria have to fight this huge concentration gradient in order to grab enough iron to proliferate," he said.

A. baumannii makes three siderophores which work in concert to create a gradient of iron chelation that feeds the metal back to the bacterial cell. But in this research he focused on acetintobactin, a siderophore found in every single clinical isolate of A. baumannii.

A fish pathogen provides a clue

The structure of acinetobactin was published in 1994, and, by 1997, ,scientists had discovered that it was created by the rearrangement (isomerization) of a precursor molecule called pre-acinetobactin.

Wencewicz knew that the fish pathogen Vibrio anguillarum makes a similar compound, called pre-anguibactin, but pre-anguibactin is locked in the "pre" form and does not isomerize. So in this case, it seemed, the "pre" form is a functional siderophore.

He wondered which of the two forms of acinetobactin was the real siderophore: the pre-acinetobactin, the acinetobactin—or both.

He also knew from the literature that A. baumannii could prosper over a wide range of pHs but most sites of infection are acidic. En réalité, A. baumannii can induce lactic acidosis by lowering the pH of its surroundings by converting glucose to lactic acid and secreting the acid.

So as a first step his lab measured pre-acinobactin's rate of isomerization over a pH range from 5.5 to 8.0 (roughly from the pH of Pepto Bismol to the pH of baking soda).

"We discovered that pre-acinetobacin is stable at a slightly acidic pH of 5, but at the more basic pH of 8, it rapidly isomerizes to acnetobactin," Wencewicz said.

Why is this siderophore pH sensitive? "Suppose A. baumannii has established itself in a slightly acidic open wound," Wencewicz said, "but depletes the resources there. To gain access to more nutrients it enters the bloodstream, but the pH of blood is 7.4 not 5. When the pH of the bacterium's environment changes, the pre-acinetobactin converts to acinetobactin, which performs better at the new pH."

In short, A. baumannii has evolved a two-for-one siderophore whose conversion from one form to another is triggered by a change in pH.

This strategy pays off, Wencewicz said, because siderophores are metabolically expensive to make. If the bacteria can make one convertible molecule, they don't have to build and maintain two separate pathways for two siderophores.

"We think this may be a general strategy," he said, "because there are other classes of siderophores that also isomerize.

"Now that we know how this siderophore works, we can properly frame techniques to block it," he said. "For example, we might attach something bulky to the siderophore so that when it docks on the bacertium's receptor, it plugs it, preventing the siderophore from ferrying the iron inside."

Wencewicz does not underestimate the enormous distance between a potential drug target and a safe and effective clinical drug.

But given the rapid evolution of bacteria, he feels we shouldn't be turning over every stone looking for new bactericidal compounds that would be just as brittle as those that have already failed. Instead, we should look for antibiotics that, if not evolution-free, at least apply much less selective pressure on bacterial communities to evolve resistance.


How do you know if it worked?

After transformation, bacteria are grown on a nutrient rich food called agar . Only bacteria containing a plasmid with antibiotic resistance will grow in the presence of antibiotic.

For example, if the bacteria are grown on agar containing the antibiotic ampicillin , only the bacteria that have been transformed with a plasmid containing the resistance gene for ampicillin will survive.

Transformed bacteria can then be grown in large amounts. The DNA of interest, or the protein coded for by the DNA, can then be isolated and purified.